论文部分内容阅读
目的 构建心肌肌钙蛋白T (cardiac troponin T,cTnT)启动子经两步转录扩增(two-step transcription amplification,TSTA)系统调控下增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为目的基因表达荧光标签的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAVV)载体(pAAV-cTnT-TSTA-EGFP),验证cTnT启动子经TSTA系统调控后的转录效果,并包装、纯化相应的腺相关病毒(adeno-associated virus,AVV).方法 利用同源重组法构建载体质粒pAAV-cTnT-TSTA-EGFP,经基因测序鉴定其序列正确性.将对数生长期人源胚胎肾细胞HEK-293T分为cTnT组(转染质粒pAAV-cTnT-EGFP),TSTA组(转染质粒pAAV-cTnT-TSTA-EGFP),巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)组(转染质粒pAAV-CMV-EGFP),对照组(不转染质粒).转染72 h,倒置荧光显微镜下观察4组EGFP荧光表达情况,应用流式细胞仪检测4组EGFP表达量.使用pAAV-cTnT-TSTA-EGFP、pAAV-R2C9及pHelper辅助质粒共转染HEK-293T细胞进行rAVV的包装,72 h后收集细胞并进行rAVV纯化,采用Western blot法检测rAVV包装是否成功,采用实时荧光定量PCR法测定纯化后病毒的滴度.结果 转染72 h,cTnT组EGFP荧光表达少,TSTA组EGFP荧光表达与CMV组基本相同;流式细胞仪检测结果显示,TSTA组EGFP表达量至少较cTnT组增强50倍,与CMV组仅相差3倍;Western blot检测结果显示,纯化后rAVV包装成功,纯化后的rAAV-cTnT-TSTA-EGFP溶液病毒滴度为2.74×1012 GC/mL.结论 TSTA系统可明显增加心肌特异性cTnT启动子对目的基因的转录表达水平.