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摘要[目的]提高梨果实多酚的提取率，研究梨成熟果多酚的提取工艺条件。[方法]利用超声波辅助提取法，在单因素试验的基础上结合正交试验对梨果实多酚的提取工艺条件进行优化。[结果] 梨成熟果多酚提取的最佳工艺条件是甲醇浓度100%、料液比1∶15（g∶mL）、超声温度50 ℃和超声时间5 min，在此条件下提取率是0.056 4 mg/g。[结论]研究可为梨加工品种的筛选及梨资源的高效利用提供参考。
关键词梨果实；多酚；提取工艺；优化
中图分类号S661.2文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）30-0102-03
Abstract [Objective]In order to improve extraction rate of polyphenol of pear fruit，to study the extraction process of polyphenols of pear fruit.[Method]The extraction technology of ultrasonic assistant was used in this paper.Orthogonal experiment was conducted based on the single factor.[Result] The optimized conditions of polyphenol of pear fruit were as follows： methanol concentration 100%，solidliquid 1∶15（g∶mL），the extraction temperature 50 ℃ and the extraction time 5 min.The yield of polyphenols was 0.056 4 mg/g.[Conclusion]The study can provide reference for the selection of pear processing varieties and the efficient utilization of pear resources.
Key wordsPear fruit；Polyphenols；Extraction conditions；Optimization
梨是我国主要水果之一，素有“百果之宗”的美誉，在我国栽培范围广泛，种质资源极为丰富。梨果实不仅肉质脆嫩、汁多味甜，含有多种营养成分，而且还颇具芳香，适合广大消费者的口味，同时具有一定的医用价值和保健作用，梨的保健作用与其所含多酚类物质密切相关[1-3]。
近年来，随着梨副产品的日益增多，梨中多酚类物质成分引起人们的关注，酚类物质是引起梨果实褐变的主要成分[4]，并且对梨及其制品的感官品质有直接影响。已有研究主要集中在梨及梨制品褐变的控制方面，包括贮藏过程中褐变度及多酚含量变化[5]、梨果汁褐变机理[6]和梨汁酶促褐变理化因子[7]等。梨果实是加工生产梨制品的主要原材料，因此，研究梨果实中多酚类物质的组成、含量具有很大的实际意义。目前，对梨多酚提取工艺的报道仅有果皮、果心及梨幼果[8-10]，提取方法大多是溶剂静置提取法[11-12]，超声波提取法已普遍应用于苹果多酚[13]、香蕉皮多酚[14]、石榴叶多酚[15]和橘子皮多酚[16]等酚类物质的提取，具有缩短提取时间、提高提取率、减少溶剂的用量、节约能源等优点[17]。赵梅等[12]用溶剂静置提取法优化了梨幼果多酚的提取条件，但采用超声法提取梨成熟果多酚的条件优化目前尚少见报道。笔者以梨成熟果为试验材料，利用超声波提取技术，通过对提取溶剂浓度、料液比、超声时间和超声温度等提取条件的研究，对梨果实多酚的提取工艺条件进行优化，为进一步开展对酚类物质的研究奠定基础，为梨加工品种的筛选、梨制品的开发和梨资源的高效利用提供参考，也为超声提取植物多酚类物质的工业化生产提供理论和试验依据。
1材料与方法
1.1材料供试原料用中梨1号成熟果，采自中国农业科学院郑州果树研究所梨资源圃。主要试剂：
没食子酸标准品购自Sigma公司，色谱纯，稀释20倍备用；其他试剂均为分析纯。主要仪器：AB104-N电子天平，上海精密仪器仪表有限公司；KQ5200E超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；TU-1901雙光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1总多酚的提取。
选取健康成熟的梨果实，去皮去核后把果肉切成小块，迅速用液氮冷冻，粉碎机粉碎；然后准确称取粉碎后的果肉5 g，加入适量的提取溶剂，经超声浸提、过滤、旋转浓缩后定容至10 mL，即为梨果实总多酚提取液。
1.2.2总多酚含量的测定。
参考Folin-酚法[18]测定，方法稍调整，准确移取1.0 mL上述提取液，加入1.0 mL FC显色剂和3.0 mL 7.5%碳酸钠溶液于10 mL离心管中，混合均匀，避光显色30 min，在765 nm 波长下测定其吸光度。
1.2.3标准曲线的绘制。
准确称取没食子酸标准品2.75 mg，用超纯水溶解，定容至50 mL，得质量浓度为50 mg/L的标准溶液。再分别准确移取此溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于5 mL容量瓶中，加入1.0 mL FC显色剂和3.0 mL 7.5%的碳酸钠溶液，混匀，用超纯水定容至刻度处，以水作为空白对照，将上述6份标准溶液避光显色30 min，在765 nm波长下测定其吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线并进行回归分析，得出回归方程，通过标准曲线计算总多酚含量。 1.2.4多酚得率的计算。计算公式如下：
多酚提取率（mg/g）=C×V×N/m
式中，C为提取液中多酚质量浓度（mg/mL）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；m为梨成熟果果肉质量（g）。
1.2.5单因素试验。
选取提取溶剂、显色时间、溶剂浓度、料液比、超声时间和超声温度为影响因素，进行单因素试验。固定甲醇浓度100%、料液比1∶20（g∶mL）、超声温度40 ℃、超声时间10 min、功率150 W、显色时间30 min，采用不同的提取溶剂：乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇，不同的显色时间：30、60、90、120 min，不同的甲醇浓度：30%、50%、70%、90%，料液比设定为1∶1、1∶10、1∶20、1∶30 （g∶mL），超声温度设定为30、40、50、60 ℃，超声时间设定为5、10、20、30 min，分别进行单因素试验，分析各因素不同水平对梨成熟果多酚提取率的影响。
1.2.6正交试验。
在单因素试验的基础上，进一步考察甲醇浓度、料液比、超声时间和超声温度对梨成熟果总多酚提取率的影响，设计4因素3水平L9（34）的正交试验。正交试验因素水平设计见表1。
2结果与分析
2.1标准曲线的绘制
根据上述方法绘制没食子酸标准曲线如图1所示，线性回归方程y=0.075 2x+0.007 9，相关系数R2=0.997 4，其中x表示没食子酸的浓度（mg/L），y表示765 nm波长下的吸光度值。从标准曲线可以看出，在质量浓度0～8.0 mg/L范围内有较好的线性关系。
2.2单因素试验
2.2.1提取溶剂和显色时间对梨成熟果中总多酚提取率的影响。
由表2可看出，不同的显色时间下，甲醇为提取溶剂时多酚的提取率最高，但差异不大。为了节约试验时间，显色时间选30 min较合适。
2.2.2甲醇浓度对梨成熟果中总多酚提取率的影响。
由图2可看出，随着甲醇浓度的增加，多酚含量持续提高，由于甲醇浓度为70%和90%时，多酚得率之间差异显著（Sig.=0.000 0），因此，甲醇浓度选多酚提取率最高的90%。这说明多酚类物质在高浓度的甲醇溶液中溶解度增加，提取溶剂浓度低，不利于多酚物质的提取，这与赵梅等[12]、欧阳玉祝等[19]的研究结果一致。
2.2.3料液比对梨成熟果中总多酚提取率的影响。由图3可以看出，料液比1∶20（g∶mL）之前，随着料液比中溶剂用量的增大，多酚提取率逐渐增加；之后，随着料液比中溶剂用量的提高，多酚提取率反而有下降的趋势。可能是料液比达到1∶20（g∶mL）时，溶剂已经能将梨成熟果样品中的多酚物质提取出来，继续增加提取溶剂，会使其他一些杂质也溶解出来，反而使多酚提取率降低，也浪费溶剂。且料液比为1∶10（g∶mL）和料液比1∶20（g∶mL）时多酚提取率差异不显著，综合考虑试验成本和提取效率，料液比选择1∶10（g∶mL）较为合适。
2.2.4超声温度对梨成熟果中多酚提取率的影响。
由图4可看出，超声温度在30～40 ℃时，随着温度的升高，多酚含量显著增加，并且在40 ℃时，多酚含量达到最大，之后随温度的升高反而呈下降趋势。可能原因是随着温度的升高，导致已被提取出的多酚类物质发生氧化和降解反应，所以选择最佳超声温度为40 ℃。
2.2.5超声时间对梨成熟果中总多酚提取率的影响。
由图5可看出，在超声时间10和20 min条件下，多酚含量的变化并不明显，随着时间的延长，多酚含量逐渐减少，可能是由于超声时间过长导致梨果实部分多酚化学结构遭到破坏，从而使多酚提取率降低；另外，超声时间越长，消耗的能量越多，故选择最佳超声时间为10 min。
2.3正交试验优化梨果实多酚提取条件
正交试验优化结果见表2，通过各因素的极差R比较发现，RA>RB>RD>RC ，影响多酚提取率的因素依次为甲醇浓度、料液比、超声温度、超声时间，甲醇浓度和料液比是影响总多酚提取率的主要因素。综合各因素K值和直观比较，得出梨成熟果总多酚提取的最佳工艺组合为A3B3C1D3，即甲醇浓度100%，料液比1∶15（g∶mL），超声时间5 min，超声温度50 ℃。
2.4验证试验
由正交试验结果分析最佳提取工艺，在甲醇浓度100%，料液比1∶15（g∶mL），超声温度50 ℃，超声提取5 min条件下做验证试验，得到梨成熟果总多酚的提取率为0.056 4 mg/g。结果表明，此方法提取效率较高，且具有良好的稳定性，得率符合正交试验的理论推测，因此确定此工艺条件最佳。
3结论与讨论
果实中总多酚的提取溶剂多用乙醇[20-25]，梨果实中多酚的提取溶剂多用甲醇[26-27]，与该研究认为甲醇为梨成熟果实最佳提取溶剂相一致。该試验采用超声波提取法，从甲醇浓度、料液比、超声温度、超声时间几个方面，对梨成熟果实总酚的提取条件进行优化，得出影响梨果实多酚提取率的主要因素是甲醇浓度和料液比，与影响柿果多酚提取率的影响因素分析一致[28]。该研究建立了梨果实总多酚的提取方法，最佳提取条件为甲醇浓度100%，料液1∶15 （g∶mL），超声时间5 min，超声温度50 ℃，此工艺条件下多酚提取率0.056 4 mg/g。该工艺可靠、稳定，具有一定的参考价值，为梨果实多酚的进一步研究奠定基础。
参考文献
[1]
董忠义，董晓彤.梨的营养与药用功效[J].北方园艺，1996（4）：36.
[2] LI X，WANG T T，ZHOU B，et al.Chemical composition and antioxidant and antiinflammatory potential of peels and flesh from 10 different pear varieties （Pyrus spp.）[J].Food chemistry，2014，152： 531-538.
[3] CHEN J L，WANG Z F，WU J H，et al.Chemical compositional characterization of eight pear cultivars grown in China[J].Food chemistry，2007，104：268-275.
关键词梨果实；多酚；提取工艺；优化
中图分类号S661.2文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）30-0102-03
Abstract [Objective]In order to improve extraction rate of polyphenol of pear fruit，to study the extraction process of polyphenols of pear fruit.[Method]The extraction technology of ultrasonic assistant was used in this paper.Orthogonal experiment was conducted based on the single factor.[Result] The optimized conditions of polyphenol of pear fruit were as follows： methanol concentration 100%，solidliquid 1∶15（g∶mL），the extraction temperature 50 ℃ and the extraction time 5 min.The yield of polyphenols was 0.056 4 mg/g.[Conclusion]The study can provide reference for the selection of pear processing varieties and the efficient utilization of pear resources.
Key wordsPear fruit；Polyphenols；Extraction conditions；Optimization
梨是我国主要水果之一，素有“百果之宗”的美誉，在我国栽培范围广泛，种质资源极为丰富。梨果实不仅肉质脆嫩、汁多味甜，含有多种营养成分，而且还颇具芳香，适合广大消费者的口味，同时具有一定的医用价值和保健作用，梨的保健作用与其所含多酚类物质密切相关[1-3]。
近年来，随着梨副产品的日益增多，梨中多酚类物质成分引起人们的关注，酚类物质是引起梨果实褐变的主要成分[4]，并且对梨及其制品的感官品质有直接影响。已有研究主要集中在梨及梨制品褐变的控制方面，包括贮藏过程中褐变度及多酚含量变化[5]、梨果汁褐变机理[6]和梨汁酶促褐变理化因子[7]等。梨果实是加工生产梨制品的主要原材料，因此，研究梨果实中多酚类物质的组成、含量具有很大的实际意义。目前，对梨多酚提取工艺的报道仅有果皮、果心及梨幼果[8-10]，提取方法大多是溶剂静置提取法[11-12]，超声波提取法已普遍应用于苹果多酚[13]、香蕉皮多酚[14]、石榴叶多酚[15]和橘子皮多酚[16]等酚类物质的提取，具有缩短提取时间、提高提取率、减少溶剂的用量、节约能源等优点[17]。赵梅等[12]用溶剂静置提取法优化了梨幼果多酚的提取条件，但采用超声法提取梨成熟果多酚的条件优化目前尚少见报道。笔者以梨成熟果为试验材料，利用超声波提取技术，通过对提取溶剂浓度、料液比、超声时间和超声温度等提取条件的研究，对梨果实多酚的提取工艺条件进行优化，为进一步开展对酚类物质的研究奠定基础，为梨加工品种的筛选、梨制品的开发和梨资源的高效利用提供参考，也为超声提取植物多酚类物质的工业化生产提供理论和试验依据。
1材料与方法
1.1材料供试原料用中梨1号成熟果，采自中国农业科学院郑州果树研究所梨资源圃。主要试剂：
没食子酸标准品购自Sigma公司，色谱纯，稀释20倍备用；其他试剂均为分析纯。主要仪器：AB104-N电子天平，上海精密仪器仪表有限公司；KQ5200E超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；TU-1901雙光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1总多酚的提取。
选取健康成熟的梨果实，去皮去核后把果肉切成小块，迅速用液氮冷冻，粉碎机粉碎；然后准确称取粉碎后的果肉5 g，加入适量的提取溶剂，经超声浸提、过滤、旋转浓缩后定容至10 mL，即为梨果实总多酚提取液。
1.2.2总多酚含量的测定。
参考Folin-酚法[18]测定，方法稍调整，准确移取1.0 mL上述提取液，加入1.0 mL FC显色剂和3.0 mL 7.5%碳酸钠溶液于10 mL离心管中，混合均匀，避光显色30 min，在765 nm 波长下测定其吸光度。
1.2.3标准曲线的绘制。
准确称取没食子酸标准品2.75 mg，用超纯水溶解，定容至50 mL，得质量浓度为50 mg/L的标准溶液。再分别准确移取此溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于5 mL容量瓶中，加入1.0 mL FC显色剂和3.0 mL 7.5%的碳酸钠溶液，混匀，用超纯水定容至刻度处，以水作为空白对照，将上述6份标准溶液避光显色30 min，在765 nm波长下测定其吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线并进行回归分析，得出回归方程，通过标准曲线计算总多酚含量。 1.2.4多酚得率的计算。计算公式如下：
多酚提取率（mg/g）=C×V×N/m
式中，C为提取液中多酚质量浓度（mg/mL）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；m为梨成熟果果肉质量（g）。
1.2.5单因素试验。
选取提取溶剂、显色时间、溶剂浓度、料液比、超声时间和超声温度为影响因素，进行单因素试验。固定甲醇浓度100%、料液比1∶20（g∶mL）、超声温度40 ℃、超声时间10 min、功率150 W、显色时间30 min，采用不同的提取溶剂：乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇，不同的显色时间：30、60、90、120 min，不同的甲醇浓度：30%、50%、70%、90%，料液比设定为1∶1、1∶10、1∶20、1∶30 （g∶mL），超声温度设定为30、40、50、60 ℃，超声时间设定为5、10、20、30 min，分别进行单因素试验，分析各因素不同水平对梨成熟果多酚提取率的影响。
1.2.6正交试验。
在单因素试验的基础上，进一步考察甲醇浓度、料液比、超声时间和超声温度对梨成熟果总多酚提取率的影响，设计4因素3水平L9（34）的正交试验。正交试验因素水平设计见表1。
2结果与分析
2.1标准曲线的绘制
根据上述方法绘制没食子酸标准曲线如图1所示，线性回归方程y=0.075 2x+0.007 9，相关系数R2=0.997 4，其中x表示没食子酸的浓度（mg/L），y表示765 nm波长下的吸光度值。从标准曲线可以看出，在质量浓度0～8.0 mg/L范围内有较好的线性关系。
2.2单因素试验
2.2.1提取溶剂和显色时间对梨成熟果中总多酚提取率的影响。
由表2可看出，不同的显色时间下，甲醇为提取溶剂时多酚的提取率最高，但差异不大。为了节约试验时间，显色时间选30 min较合适。
2.2.2甲醇浓度对梨成熟果中总多酚提取率的影响。
由图2可看出，随着甲醇浓度的增加，多酚含量持续提高，由于甲醇浓度为70%和90%时，多酚得率之间差异显著（Sig.=0.000 0），因此，甲醇浓度选多酚提取率最高的90%。这说明多酚类物质在高浓度的甲醇溶液中溶解度增加，提取溶剂浓度低，不利于多酚物质的提取，这与赵梅等[12]、欧阳玉祝等[19]的研究结果一致。
2.2.3料液比对梨成熟果中总多酚提取率的影响。由图3可以看出，料液比1∶20（g∶mL）之前，随着料液比中溶剂用量的增大，多酚提取率逐渐增加；之后，随着料液比中溶剂用量的提高，多酚提取率反而有下降的趋势。可能是料液比达到1∶20（g∶mL）时，溶剂已经能将梨成熟果样品中的多酚物质提取出来，继续增加提取溶剂，会使其他一些杂质也溶解出来，反而使多酚提取率降低，也浪费溶剂。且料液比为1∶10（g∶mL）和料液比1∶20（g∶mL）时多酚提取率差异不显著，综合考虑试验成本和提取效率，料液比选择1∶10（g∶mL）较为合适。
2.2.4超声温度对梨成熟果中多酚提取率的影响。
由图4可看出，超声温度在30～40 ℃时，随着温度的升高，多酚含量显著增加，并且在40 ℃时，多酚含量达到最大，之后随温度的升高反而呈下降趋势。可能原因是随着温度的升高，导致已被提取出的多酚类物质发生氧化和降解反应，所以选择最佳超声温度为40 ℃。
2.2.5超声时间对梨成熟果中总多酚提取率的影响。
由图5可看出，在超声时间10和20 min条件下，多酚含量的变化并不明显，随着时间的延长，多酚含量逐渐减少，可能是由于超声时间过长导致梨果实部分多酚化学结构遭到破坏，从而使多酚提取率降低；另外，超声时间越长，消耗的能量越多，故选择最佳超声时间为10 min。
2.3正交试验优化梨果实多酚提取条件
正交试验优化结果见表2，通过各因素的极差R比较发现，RA>RB>RD>RC ，影响多酚提取率的因素依次为甲醇浓度、料液比、超声温度、超声时间，甲醇浓度和料液比是影响总多酚提取率的主要因素。综合各因素K值和直观比较，得出梨成熟果总多酚提取的最佳工艺组合为A3B3C1D3，即甲醇浓度100%，料液比1∶15（g∶mL），超声时间5 min，超声温度50 ℃。
2.4验证试验
由正交试验结果分析最佳提取工艺，在甲醇浓度100%，料液比1∶15（g∶mL），超声温度50 ℃，超声提取5 min条件下做验证试验，得到梨成熟果总多酚的提取率为0.056 4 mg/g。结果表明，此方法提取效率较高，且具有良好的稳定性，得率符合正交试验的理论推测，因此确定此工艺条件最佳。
3结论与讨论
果实中总多酚的提取溶剂多用乙醇[20-25]，梨果实中多酚的提取溶剂多用甲醇[26-27]，与该研究认为甲醇为梨成熟果实最佳提取溶剂相一致。该試验采用超声波提取法，从甲醇浓度、料液比、超声温度、超声时间几个方面，对梨成熟果实总酚的提取条件进行优化，得出影响梨果实多酚提取率的主要因素是甲醇浓度和料液比，与影响柿果多酚提取率的影响因素分析一致[28]。该研究建立了梨果实总多酚的提取方法，最佳提取条件为甲醇浓度100%，料液1∶15 （g∶mL），超声时间5 min，超声温度50 ℃，此工艺条件下多酚提取率0.056 4 mg/g。该工艺可靠、稳定，具有一定的参考价值，为梨果实多酚的进一步研究奠定基础。
参考文献
[1]
董忠义，董晓彤.梨的营养与药用功效[J].北方园艺，1996（4）：36.
[2] LI X，WANG T T，ZHOU B，et al.Chemical composition and antioxidant and antiinflammatory potential of peels and flesh from 10 different pear varieties （Pyrus spp.）[J].Food chemistry，2014，152： 531-538.
[3] CHEN J L，WANG Z F，WU J H，et al.Chemical compositional characterization of eight pear cultivars grown in China[J].Food chemistry，2007，104：268-275.