采用非对称场流分离（AF4）在线联用多角度光散射（MALS）检测器和示差折光（dRI）检测器（AF4-MALS-dRI）对天麻多糖（GEPs）的相对分子质量（M）、回转半径（Rg）和构象进行了表征。GEPs粒径分布较宽,在AF4分离过程中存在空间位阻转变效应,导致粒径大小不同的GEPs分子被同时洗脱,无法准确表征其M、Rg分布和构象。本文研究了恒定交叉流流速、指数衰减交叉流流速、样品质量浓度和垫片高度对空间位阻转变效应的影响。结果表明,较高的样品质量浓度会导致空间位阻转变现象的发生;垫片高度会影响样品的分离度和保留时间,改变空间位阻转变点（di）;对于多分散GEPs样品,指数衰减交叉流流速不仅能调整di,而且能改善样品的分离度,缩短分析时间。在样品质量浓度为0.50 mg/mL、进样体积为50μL、检测器流速为1.0 mL/min、垫片高度为350μm、初始交叉流流速由0.2 mL/min呈指数衰减至0.05 mL/min、半衰期为2 min的条件下,解决了AF4分离GEPs时存在的空间位阻转变效应问题。此外,在最佳洗脱条件下研究了不同产地及不同超声时间对GEPs的M、Rg和构象的影响。结果表明,随着超声时间的增加,云南和四川产地GEPs的Rg和M均减小,分布变窄;当超声时间为15 min时,云南产地GEPs为松散的高度支化构象,四川产地GEPs为球状构象;当超声时间增加到30 min或60 min时,两产地GEPs的构象主要为高度支化结构,表明GEPs发生了降解。实验结果证明,在最佳洗脱条件下,AF4-MALS-dRI对GEPs的表征具有良好的重复性,GEPs的Rg和M相对标准偏差分别为0.5%和1.7%。