论文部分内容阅读
【摘 要】 目的：建立白扁豆中派可林酸的定性定量研究方法。方法：采用TLC法对派可林酸进行鉴别;采用HPLC建立派可林酸的含量测定方法，采用2，4-二硝基氟苯柱前衍生，色谱柱为Hypersil BDS C18 （4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液（21∶ 0.5∶ 79） 为流动相，检测波长为390nm，流速为lmL/min，柱温30℃。结果：在TLC色谱中检出派可林酸;派可林酸在4.6～46μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，r=0.9992，加样回收率为97.61%～104.83%，RSD为2.79%。结论：该方法可靠，数据准确，重现性好。
【关键词】 白扁豆;定性定量研究;高效液相色谱法;派可林酸
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2019）16-0056-04
Abstract：Objective To establish qualitative and quantitative methods for Pipecoline acid of Lablab semen album. Methods Pipecoline acid was identified by TLC.The contents of Pipecoline acid was determined by HPLC.The sample was derivatized with chiral compound 2，4-Dinitrofluorobenzene and the separarion was performed on a Hypersil BDS C18 column （4.6mm×250mm， 5μm） by using the mobile phase consisted of CⅡ3CN-（CⅡ3）2NCOⅡ-0.025mol/L CH3COONa（21∶ 0.5∶ 79）， the flow rate was 1 mL/min， the detection wavelength was set at 390nm and the column temperature at 30℃. Results Pipecoline acid can be distinguished and has good separation. The linear range of Pipecoline acid was 4.6～46μg/mL （r=0.9992）. The recoveries ranged from 97.61% to 104.83%， RSD was 2.79%. Conclusion The method is reliable，accurate and reproducible.
Keywords：Lablab Semen Album; Qualitative and Quantitative Analysis; HPLC; Pipecoline Acid
白扁豆系豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟种子，为常用的药食两用植物，分布广泛，应用历史悠久，具有健脾化湿，和中消暑的功效。富含脂肪、多糖、蛋白质、钙、铁、磷、维生素等营养物质，临床多用于脾胃虚弱，食欲不振，大便溏泄，白带过多，暑湿吐泻，胸闷腹胀[1-5]。2015年版《中国药典》中白扁豆药材的质量控制主要包括性状、横切面鉴别、水分检查，未有定性定量指標来评价其质量。关于白扁豆质量分析方面的报道较少，仅有白扁豆中总磷脂的含量测定[6]。课题组通过对白扁豆的作用研究，发现其所含派可林酸具有明显降低番泻叶致小鼠腹泻模型小肠运动的作用[7]。研究以派可林酸为指标成分，对10个不同产地12批次白扁豆药材进行定性定量分析，以提高和完善白扁豆药材现有的质量标准，以期作为白扁豆药材的开发利用与临床应用的评价提供依据。
1 仪器与材料
1.1 材料 白扁豆来自河南（20170424、20170-325）、黑龙江（20160822）、江西（20160212）、云南（20160617）、湖南（20160618、20160824）、广西（20161005、20160826）、贵州（20160524）、安徽（20160924、20161015）8个省份，共12批次，均由湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定为豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟种子。对照品派可林酸（批号111751-200601）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪（SPD-20A紫外-可见检测器，SHIMADZU LabSolution数据处理系统，日本岛津）;XPE-105十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo）;HX-06型超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）;HH-S2型数显恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）;ZN-200A高速中药粉碎机;80-2离心沉淀器;101-2电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）;硅胶G薄层色谱板（青岛化工）;0.45μm微孔滤膜（Hypersil）。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别 取白扁豆样品，每批适量，分别粉碎，过80目筛，每批取粉末各2g，分别加水20mL，加热回流20min，离心，取上清液，蒸干，残渣加70%乙醇5mL使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取派可林酸对照品适量，加稀乙醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶ 2.2∶ 1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，如图1所示。 2.2 含量测定[8-12]
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）;检测波长：390nm;流动相：乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液（21∶ 0.5∶ 79）;流速：1.0mL/min;柱温：室温;理论板数按派可林酸峰计算应不低于5000。
2.2.2 对照品溶液的制备 取派可林酸对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀;精密量取1mL，置10mL具塞试管中，加水1mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分数次洗涤溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取白扁豆药材粉末（批号：20170424）约1.0g，精密称定，置10mL具塞试管中，加水适量，充分振摇后，于60℃水浴中加热30min，取出，放冷，移至10mL量瓶中，用水分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。离心（12000r/min）10min，精密量取上清液2mL，置10mL具塞试管中，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分数次洗涤溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.4 测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按2.2.1色谱条件测定，即得。结果如图2所示。
2.2.5 线性关系考察 取派可林酸对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀;分别精密吸取0.2、 0.5、1、1.5、2mL，置10mL具塞试管中，分别加水1.8、1.5、1、0.5、0mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分数次洗涤溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。按2.2.1色谱条件测定其峰面积，以派可林酸浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：y=（5E+06）x+57506，r=0.9992。结果表明派可林酸在4.6～46μg/mL范围内具有良好的线性关系。
2.2.6 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，重复进样6次，派可林酸峰面积的RSD为1.50%，说明仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20170424），分别在0、4、8、12、24h精密吸取10μL，进样测定，计算结果RSD为0.59%，说明供试品溶液在24h内稳定。
2.2.8 重复性试验 取同一批号样品（批号：20170424）6份，分别制备供试品溶液，测定、计算。结果6份样品平均含量为1.60 mg/g，RSD为1.28%，说明方法重复性良好。
2.2.9 回收率试验 精密称取已知含量的白扁豆样品（批号：20170424）粉末6份，每份约0.5g，向各份样品中精密加入派可林酸对照品溶液（每1mL含派可林酸0.23mg）3.5mL，照供试品溶液的方法制备，按上述条件进行测定，计算回收率，平均值为101.15%， RSD为2.79%。结果见表1。
2.2.10 12批白扁豆测定数据 分别取12批白扁豆，按2.2.3供试品溶液制备方法制备供试品溶液，每批两份，分别精密吸取各供试品溶液10μL，进样，按2.2.1色谱条件，依法测定峰面积，计算各供试液中派可林酸的含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 提取溶剂的考察 分别采用水、40%乙醇及乙醇对白扁豆进行提取，提取液衍生后测定，结果用水作溶剂，派可林酸含量最高，但水作溶剂，提取后溶液较难过滤，因此须采用离心的方法。
3.2 衍生剂用量的考察 试验中比较了衍生剂的用量1mL、2mL、3mL，结果加1mL 0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生剂，虽然派可林酸含量與加2mL或3mL差不多，但由于峰面积对比可知，衍生剂用量为1.0mL时并未反应完全，说明衍生化不完全，加2mL或3mL 0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生剂，派可林酸含量与峰面积均相差不大，因此选择2mL。
3.3 衍生温度的考察 比较了40℃、60℃、80℃水浴中各放置1h，结果40℃下制备的供试液与对照品溶液派可林酸峰面积最小，说明衍生化不完全，置于60℃或80℃水浴中1h，派可林酸峰面积与含量无差别，因此选择60℃。
3.4 含量测定结果分析 应用所建立的方法对12批白扁豆中派可林酸进行含量测定，12批平均含量为0.13%，最高含量0.24%，最低含量为0.06%，其中含量大于0.08%的有10个样品，占全部样品的83.3%。
研究建立了派可林酸定性、定量测定方法稳定、可靠、重复性好，建议进一步增加样本量，制定合理的限度，同时对派可林酸的药效深入研究，从而更加科学、全面地控制白扁豆的质量。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：110.
[2]郑琳，赵海泉.白扁豆淀粉性质的研究[J]. 安徽农业大学学报，2010，37（2）：214-217.
[3]刘振启，刘杰.白扁豆的鉴别与药食研究[J].传统中医药，2014（5）：48.
[4]宋英杰，崔希凤，迟香芸.豆车散治疗小儿慢性腹泻10例[J].中国民间疗法，2001，9（12）：45-46.
[5]吕霜，杨燕，盛燕，等.小儿腹泻病临床疗效类文献的相关研究[J].北京中医药，2010，29（9）：657-658.
[6]杨立皇，童巧珍，周日宝，等.湖南省GAP种植基地药材白扁豆中总磷脂中的含量测定研究[J].中医药导报，2007，13（6）：4-11.
[7]李海洋.白扁豆止泻成分及质量标准规范化研究[D].长沙：湖南中医药大学，2018.
[8]颜丽珍.高效液相色谱法测定蚕砂中派可林酸的含量[J]. 海峡药学，2005，17（2）：55-56.
[9]苏凤莲.高效液相色谱法测定金糖宁胶囊中派可林酸的含量[J].海峡药学，2001，13（3）：42.
[10]于娟，杜守颖，吴丽璇，等.高效液相色谱法测定金糖宁胶囊中1-脱氧野尻霉素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（18）：62-64.
[11]万绍晖，徐玫，王荔，等.反相高效液相色谱柱前衍生化法测定复方板蓝根颗粒中氨基酸的含量[J].中药材，2005，28（7）：594-596.
[12]冯玲玲，岳淑梅，万绍晖，等.反相高效液相色谱—柱前衍生化法测定大青叶中氨基酸的含量[J].中国药房，2006，17（9）：694-695.
（收稿日期：2019-06-18 编辑：刘 斌）
【关键词】 白扁豆;定性定量研究;高效液相色谱法;派可林酸
【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2019）16-0056-04
Abstract：Objective To establish qualitative and quantitative methods for Pipecoline acid of Lablab semen album. Methods Pipecoline acid was identified by TLC.The contents of Pipecoline acid was determined by HPLC.The sample was derivatized with chiral compound 2，4-Dinitrofluorobenzene and the separarion was performed on a Hypersil BDS C18 column （4.6mm×250mm， 5μm） by using the mobile phase consisted of CⅡ3CN-（CⅡ3）2NCOⅡ-0.025mol/L CH3COONa（21∶ 0.5∶ 79）， the flow rate was 1 mL/min， the detection wavelength was set at 390nm and the column temperature at 30℃. Results Pipecoline acid can be distinguished and has good separation. The linear range of Pipecoline acid was 4.6～46μg/mL （r=0.9992）. The recoveries ranged from 97.61% to 104.83%， RSD was 2.79%. Conclusion The method is reliable，accurate and reproducible.
Keywords：Lablab Semen Album; Qualitative and Quantitative Analysis; HPLC; Pipecoline Acid
白扁豆系豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟种子，为常用的药食两用植物，分布广泛，应用历史悠久，具有健脾化湿，和中消暑的功效。富含脂肪、多糖、蛋白质、钙、铁、磷、维生素等营养物质，临床多用于脾胃虚弱，食欲不振，大便溏泄，白带过多，暑湿吐泻，胸闷腹胀[1-5]。2015年版《中国药典》中白扁豆药材的质量控制主要包括性状、横切面鉴别、水分检查，未有定性定量指標来评价其质量。关于白扁豆质量分析方面的报道较少，仅有白扁豆中总磷脂的含量测定[6]。课题组通过对白扁豆的作用研究，发现其所含派可林酸具有明显降低番泻叶致小鼠腹泻模型小肠运动的作用[7]。研究以派可林酸为指标成分，对10个不同产地12批次白扁豆药材进行定性定量分析，以提高和完善白扁豆药材现有的质量标准，以期作为白扁豆药材的开发利用与临床应用的评价提供依据。
1 仪器与材料
1.1 材料 白扁豆来自河南（20170424、20170-325）、黑龙江（20160822）、江西（20160212）、云南（20160617）、湖南（20160618、20160824）、广西（20161005、20160826）、贵州（20160524）、安徽（20160924、20161015）8个省份，共12批次，均由湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定为豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟种子。对照品派可林酸（批号111751-200601）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪（SPD-20A紫外-可见检测器，SHIMADZU LabSolution数据处理系统，日本岛津）;XPE-105十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo）;HX-06型超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司）;HH-S2型数显恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）;ZN-200A高速中药粉碎机;80-2离心沉淀器;101-2电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）;硅胶G薄层色谱板（青岛化工）;0.45μm微孔滤膜（Hypersil）。
2 方法与结果
2.1 薄层鉴别 取白扁豆样品，每批适量，分别粉碎，过80目筛，每批取粉末各2g，分别加水20mL，加热回流20min，离心，取上清液，蒸干，残渣加70%乙醇5mL使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取派可林酸对照品适量，加稀乙醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液10μL，对照品溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶ 2.2∶ 1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，如图1所示。 2.2 含量测定[8-12]
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）;检测波长：390nm;流动相：乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液（21∶ 0.5∶ 79）;流速：1.0mL/min;柱温：室温;理论板数按派可林酸峰计算应不低于5000。
2.2.2 对照品溶液的制备 取派可林酸对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀;精密量取1mL，置10mL具塞试管中，加水1mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分数次洗涤溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取白扁豆药材粉末（批号：20170424）约1.0g，精密称定，置10mL具塞试管中，加水适量，充分振摇后，于60℃水浴中加热30min，取出，放冷，移至10mL量瓶中，用水分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。离心（12000r/min）10min，精密量取上清液2mL，置10mL具塞试管中，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分数次洗涤溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.4 测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按2.2.1色谱条件测定，即得。结果如图2所示。
2.2.5 线性关系考察 取派可林酸对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀;分别精密吸取0.2、 0.5、1、1.5、2mL，置10mL具塞试管中，分别加水1.8、1.5、1、0.5、0mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.0）分数次洗涤溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得。按2.2.1色谱条件测定其峰面积，以派可林酸浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：y=（5E+06）x+57506，r=0.9992。结果表明派可林酸在4.6～46μg/mL范围内具有良好的线性关系。
2.2.6 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，重复进样6次，派可林酸峰面积的RSD为1.50%，说明仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20170424），分别在0、4、8、12、24h精密吸取10μL，进样测定，计算结果RSD为0.59%，说明供试品溶液在24h内稳定。
2.2.8 重复性试验 取同一批号样品（批号：20170424）6份，分别制备供试品溶液，测定、计算。结果6份样品平均含量为1.60 mg/g，RSD为1.28%，说明方法重复性良好。
2.2.9 回收率试验 精密称取已知含量的白扁豆样品（批号：20170424）粉末6份，每份约0.5g，向各份样品中精密加入派可林酸对照品溶液（每1mL含派可林酸0.23mg）3.5mL，照供试品溶液的方法制备，按上述条件进行测定，计算回收率，平均值为101.15%， RSD为2.79%。结果见表1。
2.2.10 12批白扁豆测定数据 分别取12批白扁豆，按2.2.3供试品溶液制备方法制备供试品溶液，每批两份，分别精密吸取各供试品溶液10μL，进样，按2.2.1色谱条件，依法测定峰面积，计算各供试液中派可林酸的含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 提取溶剂的考察 分别采用水、40%乙醇及乙醇对白扁豆进行提取，提取液衍生后测定，结果用水作溶剂，派可林酸含量最高，但水作溶剂，提取后溶液较难过滤，因此须采用离心的方法。
3.2 衍生剂用量的考察 试验中比较了衍生剂的用量1mL、2mL、3mL，结果加1mL 0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生剂，虽然派可林酸含量與加2mL或3mL差不多，但由于峰面积对比可知，衍生剂用量为1.0mL时并未反应完全，说明衍生化不完全，加2mL或3mL 0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生剂，派可林酸含量与峰面积均相差不大，因此选择2mL。
3.3 衍生温度的考察 比较了40℃、60℃、80℃水浴中各放置1h，结果40℃下制备的供试液与对照品溶液派可林酸峰面积最小，说明衍生化不完全，置于60℃或80℃水浴中1h，派可林酸峰面积与含量无差别，因此选择60℃。
3.4 含量测定结果分析 应用所建立的方法对12批白扁豆中派可林酸进行含量测定，12批平均含量为0.13%，最高含量0.24%，最低含量为0.06%，其中含量大于0.08%的有10个样品，占全部样品的83.3%。
研究建立了派可林酸定性、定量测定方法稳定、可靠、重复性好，建议进一步增加样本量，制定合理的限度，同时对派可林酸的药效深入研究，从而更加科学、全面地控制白扁豆的质量。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：110.
[2]郑琳，赵海泉.白扁豆淀粉性质的研究[J]. 安徽农业大学学报，2010，37（2）：214-217.
[3]刘振启，刘杰.白扁豆的鉴别与药食研究[J].传统中医药，2014（5）：48.
[4]宋英杰，崔希凤，迟香芸.豆车散治疗小儿慢性腹泻10例[J].中国民间疗法，2001，9（12）：45-46.
[5]吕霜，杨燕，盛燕，等.小儿腹泻病临床疗效类文献的相关研究[J].北京中医药，2010，29（9）：657-658.
[6]杨立皇，童巧珍，周日宝，等.湖南省GAP种植基地药材白扁豆中总磷脂中的含量测定研究[J].中医药导报，2007，13（6）：4-11.
[7]李海洋.白扁豆止泻成分及质量标准规范化研究[D].长沙：湖南中医药大学，2018.
[8]颜丽珍.高效液相色谱法测定蚕砂中派可林酸的含量[J]. 海峡药学，2005，17（2）：55-56.
[9]苏凤莲.高效液相色谱法测定金糖宁胶囊中派可林酸的含量[J].海峡药学，2001，13（3）：42.
[10]于娟，杜守颖，吴丽璇，等.高效液相色谱法测定金糖宁胶囊中1-脱氧野尻霉素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（18）：62-64.
[11]万绍晖，徐玫，王荔，等.反相高效液相色谱柱前衍生化法测定复方板蓝根颗粒中氨基酸的含量[J].中药材，2005，28（7）：594-596.
[12]冯玲玲，岳淑梅，万绍晖，等.反相高效液相色谱—柱前衍生化法测定大青叶中氨基酸的含量[J].中国药房，2006，17（9）：694-695.
（收稿日期：2019-06-18 编辑：刘 斌）