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中图分类号:R743.3 文献标 识码:A 文章编号:1009_816X(2010)04_0270_03
DOI:10.3969/j.issn.1009_816X.2010.04.07
Explore the Intracranial Hematoncus Penumbra and Time Window in Rats. TIAN Wei,ZHAO Qiang,GAO Chang, et al. Department of Neurology, Ningbo development zone s central hospital, Zhejiang 315800, China
[Abstract] ObjectiveTo study penumbra of perihematoma and the time window in r at model of intracerebral hemorrhage.MethodsWe used coagulated autologous blo od to establish the rat model of intracerebral hemorrhage and employed TTC and H E staining to identify normal tissue、ischemic tissue、and necrotic foci. Theischemic scope and necrotic scope were analyzed quantitatively by image analysi s technique. Furthermore, the time window of perihematoma penumbra area was dete rmined by statistical analysis of perihematoma penumbra area at different time g roups.Results It suggested that penumbra index would gradually reduce with theincrease of post hemorrhage time according to groups of 2h、3h、4h and 6h in r at model of intracerebral hemorrhage, the penumbra index was significantly lowerin 6h group than in 2h and 3h groups (P<0.01).Conclusions There was a penumbra round the hematoma, the time windows of penumbra was 4 hour s.
[Key words] Intracerebral hemorrhage; Penumbra of perihematoma ; Time window; Rats
缺血半暗带的概念最早由Astrup于1977年提出[1]。其主要特征为缺血性、可逆性 、 存在的时限性即时间窗。本文旨在探讨脑出血血肿周边脑组织随着出血时间的不同是否存 在着类似脑梗死病理变化的半暗带,并进一步探讨其时间窗。
1 材料与方法
1.1 动物模型:实验动物选择清洁级SD大鼠,(由复旦大学动物实验科学部提供)体重21 0～240g,采用配对设计,分成4组(2 小时、3 小时、4小时及6小时,每组10只,每组中有 一只来源于同一窝别,体重相似,配成对子),6小时组与其它组进行两两比较。另取SD大 鼠6只,编入假手术对照组。
1.2 实验方法:1)大鼠用10%水合氯醛腹腔内麻醉(4uL/g),完成立体定向术后仰卧位固定 ,暴露并分离右侧股动脉,结扎远心端。100uL自体动脉血抽入0.25ml注射器中,结扎股动 脉近心端。2)血液在注射器中静置5～10分钟使之凝固;外置套管用7号注射针头改制,距针 尖6mm处焊锡,内置管为4号注射针头,头端均磨钝平,并保障通畅;栓子用4号针头改制。 注射时应用瞬间粘合剂将外置套管与颅骨及内置套管粘紧。3)将凝固血匀速注入靶点( 前囟前1mm,中线向左旁开3mm,深度为颅骨表面向下6mm)内,注射速度20uL/min。留针30m in后拔除套管针。4)用自制大鼠脑组织切片模具将脑组织切成1mm厚冠状面薄片。大体观察 血肿形态并照相。5)假手术组大鼠完成立体定向术及股动脉抽血,但不注血。
1.3 半暗带面积的测定:1)各实验组大鼠术后分别饲养2h、3h、4h和6h时间,再次麻醉后 断头取脑,立即用脑组织切片模具切取针道平面前后两片相邻脑片(厚度2mm)。2)针道前 一片脑片浸泡在2%TTC内避光震荡孵育15min(37℃),置10%甲醛内避光浸泡固定过夜 (4℃),TTC染色用来区分正常及缺血组织,将图像输入图像分析系统,计算缺血范围面积 。3)针道后一片新鲜脑组织速冻后在针道相邻面进行冰冻切片,HE染色,光镜下即可辨认出 坏死组织。输入图像分析系统,计算梗死灶面积。4)每只大鼠将缺血范围面积减去梗死灶面 积计算出半暗带面积,并换算成半暗带系数(半暗带面积/总缺血范围面积),评估半暗带 时间窗。
1.4 统计学方法:用SPSS 11.5软件包分析半暗带系数进行统计分析。(配对t检验 )。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2h、3h、4h和6h组的半暗带指数随着出血后时间的增加而逐步降低见表1。与出血后4h组比 较,出血后6h组半暗带指数同样表现出随着出血后时间的延长而呈继续降低的趋势,但尚未 出现统计学差异,而与2h和3h组比较,显著降低,具有统计学差异(P<0.01)。
3 讨论
Tanizaki[2]在1988年提出脑出血血肿周围可能与脑梗死同样存在缺血半暗带的观 点,但争论持续至今。有的实验研究显示血肿周围脑血流量(cerebral blood flow,CBF)并 没有下降至缺血损伤阈值(15～25ml/100g/min)以下,而且持续时间大都不超过4小时。Nat h等采用大鼠自体动脉血模型、用放射自显影等技术发现CBF在最初3h内即恢复正常[3 ]。Lee等采用大鼠脑内注射凝血酶方法,发现血脑屏障(blood_brain barrier,BBB)被 破坏,但CBF不受影响[4]。日本学者Yonezava等用胶原酶脑内注射的方法,血肿周 围CBF下降过程短暂,有自动调节恢复现象[5]。由此认为血肿周围的缺血程度不会 导致半暗带产生。我们分析发现,以上研究分别采用常用的高血压脑出血(ICH)动物模型 [6]中的自体血注入高血压脑出血(ICH)模型、胶原酶诱导ICH模型、凝血酶注射模型 等。自体血模型的缺陷在于新鲜自体血脑内注射时由于针道返流现象的存在,原发部位血肿 很小,凝血酶注射不会产生占位效应,只能说明凝血酶不会影响脑血流量,不能排除血肿导 致血肿周围组织缺血的可能性。胶原酶模型的出血灶为渗血所致,出血过程缓慢,占位效应 也不明显,且因胶原酶对血管的破坏作用,使得该模型血肿周围的血液循环情况与临床脑出 血有较大差别。我们认为占位效应可能是导致血肿周围半暗带形成的主要因素,本文应用了 改良的自体血注入ICH的模型即自体凝固血脑内注射的方法,该模型血肿更加规则,与临床 脑出血有更好的相似性。同时自体血注入的血量方面,文献多用50～100μl[7], 为保证占位征象更明显,我们采用100μl的注射量,并应用TTC染色及HE染色的方法观察, TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,可间接标记脑缺血面积, 而HE染色光镜下即可显示脑梗死面积。本文结果显示血肿周围存在着明确的半暗带,且半 暗带的时间窗为4小时。这与国内外大量基础及临床研究相似。Sinar EJ等用大鼠尾状核微 气囊模型利用氢清除法和放射自显影技术研究,发现微气囊一过性膨胀31%病灶侧尾状核组 织平均脑血流CBF值下降至20ml/100g/min以下,并且这一现象持续了4小时。认为占位效应 导致了脑缺血[8]。Kingman等的研究得出了相似的结论[9]。
参考文献
[1]Astrup J, Symon L, Branston MM, et al. Cortical evoked potential an d extracellular K+ and H+ at critical levels of brain ischemia[J]. Stroke,197 7,8(1):51-57.
[2]Tanizaki T. Improvement of cerebral blood flow following stereotactic surge ry in patients with putaminal haemorrhage[J]. Acta Neurochir(Wien),1988,90:103 -110.
[3]Nath FP, Kelly PT, Jenkins A, et al. Effect of experimental intracerebral h emorrhage on blood flow,capillary permeability, and histochemistry[J]. J Neuro surg,1987,66(4):555-562.
[4]Lee KR, Kawaii N, Kim S, et al. Mechanism of edema formation after intracer ebral hemorrhage: Effect of thrombin on cerebral blood flow, blood_brain barrierpermeability, and cell survival in rat model[J]. J Neurosurg,1997,86(2):272- 278.
[5]Yonezava T, Hashimoto H, Sakaki T. Serial chang of cerebral blood flow afte r collagenase induced intracerebral hemorrhage. in rats[J]. No Shinkei Geka,19 99,27:419-425.
[6]李红玲,樊金兰,陈维.脑出血实验动物模型[J]. Neural Injury and Functional Re const runruction, November,2006,1(4):130.
[7]陈彦克,陈衔城.自发性脑出血动物模型[J].国外医学•脑血管分册,2004,12(8):576 -6781.
[8]Sinar EJ, Mendelow AD, Graham DI, et al. GM. Experimental intracerebral he morrhage: effects of a temporary mass lesion[J]. J Neurosurg,1987,66(4):568- 576.
[9]Kingman TA, Mendelow AD, Graham DI, et al. Experimental intracerebral mass:time_related effects on local cerebral blood flow[J]. J Neurosurg,1987,67(5 ):732-738.
DOI:10.3969/j.issn.1009_816X.2010.04.07
Explore the Intracranial Hematoncus Penumbra and Time Window in Rats. TIAN Wei,ZHAO Qiang,GAO Chang, et al. Department of Neurology, Ningbo development zone s central hospital, Zhejiang 315800, China
[Abstract] ObjectiveTo study penumbra of perihematoma and the time window in r at model of intracerebral hemorrhage.MethodsWe used coagulated autologous blo od to establish the rat model of intracerebral hemorrhage and employed TTC and H E staining to identify normal tissue、ischemic tissue、and necrotic foci. Theischemic scope and necrotic scope were analyzed quantitatively by image analysi s technique. Furthermore, the time window of perihematoma penumbra area was dete rmined by statistical analysis of perihematoma penumbra area at different time g roups.Results It suggested that penumbra index would gradually reduce with theincrease of post hemorrhage time according to groups of 2h、3h、4h and 6h in r at model of intracerebral hemorrhage, the penumbra index was significantly lowerin 6h group than in 2h and 3h groups (P<0.01).Conclusions There was a penumbra round the hematoma, the time windows of penumbra was 4 hour s.
[Key words] Intracerebral hemorrhage; Penumbra of perihematoma ; Time window; Rats
缺血半暗带的概念最早由Astrup于1977年提出[1]。其主要特征为缺血性、可逆性 、 存在的时限性即时间窗。本文旨在探讨脑出血血肿周边脑组织随着出血时间的不同是否存 在着类似脑梗死病理变化的半暗带,并进一步探讨其时间窗。
1 材料与方法
1.1 动物模型:实验动物选择清洁级SD大鼠,(由复旦大学动物实验科学部提供)体重21 0～240g,采用配对设计,分成4组(2 小时、3 小时、4小时及6小时,每组10只,每组中有 一只来源于同一窝别,体重相似,配成对子),6小时组与其它组进行两两比较。另取SD大 鼠6只,编入假手术对照组。
1.2 实验方法:1)大鼠用10%水合氯醛腹腔内麻醉(4uL/g),完成立体定向术后仰卧位固定 ,暴露并分离右侧股动脉,结扎远心端。100uL自体动脉血抽入0.25ml注射器中,结扎股动 脉近心端。2)血液在注射器中静置5～10分钟使之凝固;外置套管用7号注射针头改制,距针 尖6mm处焊锡,内置管为4号注射针头,头端均磨钝平,并保障通畅;栓子用4号针头改制。 注射时应用瞬间粘合剂将外置套管与颅骨及内置套管粘紧。3)将凝固血匀速注入靶点( 前囟前1mm,中线向左旁开3mm,深度为颅骨表面向下6mm)内,注射速度20uL/min。留针30m in后拔除套管针。4)用自制大鼠脑组织切片模具将脑组织切成1mm厚冠状面薄片。大体观察 血肿形态并照相。5)假手术组大鼠完成立体定向术及股动脉抽血,但不注血。
1.3 半暗带面积的测定:1)各实验组大鼠术后分别饲养2h、3h、4h和6h时间,再次麻醉后 断头取脑,立即用脑组织切片模具切取针道平面前后两片相邻脑片(厚度2mm)。2)针道前 一片脑片浸泡在2%TTC内避光震荡孵育15min(37℃),置10%甲醛内避光浸泡固定过夜 (4℃),TTC染色用来区分正常及缺血组织,将图像输入图像分析系统,计算缺血范围面积 。3)针道后一片新鲜脑组织速冻后在针道相邻面进行冰冻切片,HE染色,光镜下即可辨认出 坏死组织。输入图像分析系统,计算梗死灶面积。4)每只大鼠将缺血范围面积减去梗死灶面 积计算出半暗带面积,并换算成半暗带系数(半暗带面积/总缺血范围面积),评估半暗带 时间窗。
1.4 统计学方法:用SPSS 11.5软件包分析半暗带系数进行统计分析。(配对t检验 )。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2h、3h、4h和6h组的半暗带指数随着出血后时间的增加而逐步降低见表1。与出血后4h组比 较,出血后6h组半暗带指数同样表现出随着出血后时间的延长而呈继续降低的趋势,但尚未 出现统计学差异,而与2h和3h组比较,显著降低,具有统计学差异(P<0.01)。
3 讨论
Tanizaki[2]在1988年提出脑出血血肿周围可能与脑梗死同样存在缺血半暗带的观 点,但争论持续至今。有的实验研究显示血肿周围脑血流量(cerebral blood flow,CBF)并 没有下降至缺血损伤阈值(15～25ml/100g/min)以下,而且持续时间大都不超过4小时。Nat h等采用大鼠自体动脉血模型、用放射自显影等技术发现CBF在最初3h内即恢复正常[3 ]。Lee等采用大鼠脑内注射凝血酶方法,发现血脑屏障(blood_brain barrier,BBB)被 破坏,但CBF不受影响[4]。日本学者Yonezava等用胶原酶脑内注射的方法,血肿周 围CBF下降过程短暂,有自动调节恢复现象[5]。由此认为血肿周围的缺血程度不会 导致半暗带产生。我们分析发现,以上研究分别采用常用的高血压脑出血(ICH)动物模型 [6]中的自体血注入高血压脑出血(ICH)模型、胶原酶诱导ICH模型、凝血酶注射模型 等。自体血模型的缺陷在于新鲜自体血脑内注射时由于针道返流现象的存在,原发部位血肿 很小,凝血酶注射不会产生占位效应,只能说明凝血酶不会影响脑血流量,不能排除血肿导 致血肿周围组织缺血的可能性。胶原酶模型的出血灶为渗血所致,出血过程缓慢,占位效应 也不明显,且因胶原酶对血管的破坏作用,使得该模型血肿周围的血液循环情况与临床脑出 血有较大差别。我们认为占位效应可能是导致血肿周围半暗带形成的主要因素,本文应用了 改良的自体血注入ICH的模型即自体凝固血脑内注射的方法,该模型血肿更加规则,与临床 脑出血有更好的相似性。同时自体血注入的血量方面,文献多用50～100μl[7], 为保证占位征象更明显,我们采用100μl的注射量,并应用TTC染色及HE染色的方法观察, TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应,生成红色的甲月赞,可间接标记脑缺血面积, 而HE染色光镜下即可显示脑梗死面积。本文结果显示血肿周围存在着明确的半暗带,且半 暗带的时间窗为4小时。这与国内外大量基础及临床研究相似。Sinar EJ等用大鼠尾状核微 气囊模型利用氢清除法和放射自显影技术研究,发现微气囊一过性膨胀31%病灶侧尾状核组 织平均脑血流CBF值下降至20ml/100g/min以下,并且这一现象持续了4小时。认为占位效应 导致了脑缺血[8]。Kingman等的研究得出了相似的结论[9]。
参考文献
[1]Astrup J, Symon L, Branston MM, et al. Cortical evoked potential an d extracellular K+ and H+ at critical levels of brain ischemia[J]. Stroke,197 7,8(1):51-57.
[2]Tanizaki T. Improvement of cerebral blood flow following stereotactic surge ry in patients with putaminal haemorrhage[J]. Acta Neurochir(Wien),1988,90:103 -110.
[3]Nath FP, Kelly PT, Jenkins A, et al. Effect of experimental intracerebral h emorrhage on blood flow,capillary permeability, and histochemistry[J]. J Neuro surg,1987,66(4):555-562.
[4]Lee KR, Kawaii N, Kim S, et al. Mechanism of edema formation after intracer ebral hemorrhage: Effect of thrombin on cerebral blood flow, blood_brain barrierpermeability, and cell survival in rat model[J]. J Neurosurg,1997,86(2):272- 278.
[5]Yonezava T, Hashimoto H, Sakaki T. Serial chang of cerebral blood flow afte r collagenase induced intracerebral hemorrhage. in rats[J]. No Shinkei Geka,19 99,27:419-425.
[6]李红玲,樊金兰,陈维.脑出血实验动物模型[J]. Neural Injury and Functional Re const runruction, November,2006,1(4):130.
[7]陈彦克,陈衔城.自发性脑出血动物模型[J].国外医学•脑血管分册,2004,12(8):576 -6781.
[8]Sinar EJ, Mendelow AD, Graham DI, et al. GM. Experimental intracerebral he morrhage: effects of a temporary mass lesion[J]. J Neurosurg,1987,66(4):568- 576.
[9]Kingman TA, Mendelow AD, Graham DI, et al. Experimental intracerebral mass:time_related effects on local cerebral blood flow[J]. J Neurosurg,1987,67(5 ):732-738.