【摘 要】
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以往在研究由促癌物12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13 -acetate,TPA)诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时,曾获得中性粒细胞
【机 构】
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汕头大学医学院肿瘤病理研究室,汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室,中国预防医学科学院病毒学研究所
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以往在研究由促癌物12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13 -acetate,TPA)诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时,曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)等新的食管癌癌变相关基因.为深入研究这些癌变相关基因在食管癌中以蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用为基础的功能网络调控关系,建立了一个食管癌cDNA酵母杂交文库.采用Trizol试剂从一种新的人食管癌细胞(SHEEC,由人永生化食管上皮细胞转化而来)中提取细胞总RNA,采用Oligotex mRNA Kit从细胞总RNA中制备PolyA+ mRNA,采用SuperScriptTM Choice System For cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以PolyA+ mRNA为探针,化学发光法监测cDNA合成的质量,以pGADT7为载体构建了SHEEC细胞的cDNA酵母杂交文库.文库的滴度为1.19×109 cfu/ml,重组片段大小主要集中在0.5～6.0 kb,重组率为50%.在此基础上,应用酵母单杂交技术手段对该文库中的NF-κB元件结合因子进行了筛选,在SD/-his/-leu/[+15 mmol/L 3-AT]缺陷培养基平板上共获得了约360个单克隆.按照平板上酵母单克隆直径的大小,选择直径大于2 mm者91个,提取质粒进行酶切鉴定和一对一酵母单杂交验证实验,结果获得了30个阳性重组子,并随机取其中的9个阳性重组子进行测序和GenBank/BLAST同源分析,发现某些基因编码的蛋白质产物在关键氨基酸残基位点上与p65和p50的NF-κB元件结合域公共序列具有高度一致性.这些实验结果表明,所构建的人食管癌cDNA酵母杂交文库是成功的.
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