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摘要 以5%～30%浓度的甘油作为精液冷冻保护剂，以0.5 mL麦管和1.8 mL麦管作为精液冻存容器，进行七彩鲑冻精的受精试验。试验结果表明：20%浓度甘油组的受精率达到了51.08%～61.56%，显著高于其他浓度甘油组的受精率；在20%～25%甘油浓度中0.5 mL麦管组的受精率均高于1.8 mL麦管组的受精率，其中20%甘油的0.5 mL麦管组，平均受精率最高，达到了61.38%。
关键词 甘油；冷冻保护剂；冷冻麦管；七彩鲑；受精率；影响
中图分类号 S961.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）01-0293-01
Effects of Different Concentrations of Glycerol as Cryoprotectant and Different Sizes of Straw on
Fertilization Rate of Salvelinus fontinalis
DENG Shuang-yi LI Sheng-zhong CHENG Pei GUAN Xiu-zhi
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi Xinjiang 830052）
Abstract The artificial fertilization experiment on Salvelinus fontinalis was carried out，using 5%～30% glycerol as cryoprotectant，and 0.5 mL and 1.8 mL straw as semen cryopreservation container. The results showed that：The fertilization rates of 20% glycerol group reached 51.08%～61.56%，which was obviously higher than other concentrations of glycerol groups. With the glycerol concentration of 20%～25%，the fertilization rates of 0.5 mL straw group were significantly higher than the fertilization rates of 1.8 mL straw group. The mean fertilization rate of 20% glycerol and 0.5 mL straw group was the highest，which reached 61.38%.
Key words glycerol；cryoprotectant；straw；Salvelinus fontinalis；fertilization rate；effect
七彩鲑（Salvelinus fontinalis）又名溪鳟，学名美洲红点鲑，属于鲑科红点鲑属，分布于加拿大东部的拉布拉多地区以及美国大西洋沿岸、五大湖与密西西比河流域、明尼苏达州和乔治亚洲北部。七彩鲑鱼色彩鲜艳，体表布满蚯蚓状的橄榄绿色花纹，胭脂色的红点镶嵌在多个天蓝的圆环中，鳞片细小，每个鳍翅下沿都有1条奶白的裙边，这是七彩鲑与其他鲑鳟的主要区别[1]。七彩鲑是鲑鱼中体形最小的一种，体重一般不超过2 kg[2]。七彩鲑对环境的变化具有极强的适应性，对温度和酸碱度的急剧变化具有很强的适应能力。尤其是对酸碱度的适应能力强，其pH值适应范围在4.8～9.8，最低可达3.5。因此，在酸度很高的水体中，七彩鲑鱼可能是唯一可以存活的冷水鱼种。另外，七彩鲑食性杂，易驯化，易饲养。为了解决七彩鲑人工繁殖过程中，雌雄亲鱼性成熟不匹配的问题，满足七彩鲑优良品种的保护和育种的需要，特开展七彩鲑精子活力调控和冷冻保存的研究。旨在探讨甘油作为冷冻保护剂对七彩鲑受精率的影响，为七彩鲑的人工繁殖提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用亲鱼来自新疆温泉县冷水鱼繁育中心，其中雌性亲鱼10尾，雄性亲鱼5尾，其平均体长分别为（38.0±2.0） cm和（36.0±3.5） cm，体重1.5～2.0 kg。供试试剂为甘油、液氮。主要仪器为液氮罐、维萨斯孵化瓶、常规手术用具等。
1.2 试验方法
1.2.1 精液稀释液的配制。分别以5%、15%、20%、25%、30%的甘油作为冷冻保护剂，配制出5种不同的精液保护液。
1.2.2 精液的采集与处理。采精前先把雄鱼体表的水用毛巾擦干，然后用手挤压雄鱼腹部，将精液挤入干燥小烧杯中，整个过程要防止精液接触水分，将5尾雄鱼精液混合，置于冰盒内，避光储存待用。对精液进行冷冻保存。将精液与上述各个浓度梯度的甘油按照1∶3的比例进行混合，然后分别吸入0.5 mL麦管和1.8 mL麦管中，密封后置于液氮槽的液氮表面上1.5 cm处，逐步降温，5 min后将麦管快速转入液氮中，10 min后将麦管放入液氮罐冷冻保存。
1.2.3 卵子的采集与保存。取性腺发育成熟的雌鱼，用毛巾将鱼体，特别是腹部擦拭干净，轻轻挤压雌鱼腹部，将鱼卵沿杯壁挤入烧杯中，避光储存待用。
1.2.4 人工授精与受精卵孵化。将冷冻保存7 d的精液取出，在30 ℃水浴中解冻30 s，然后取100 μL的冻精迅速倒入4.6 g的卵子中（精子与卵子比例约为0.4×106∶1），同时加入占卵子体积50%的养殖池水，迅速混匀，静置1～2 min后洗卵。受精卵的孵化在新疆温泉县冷水鱼繁育中心进行。采用维萨斯孵化瓶孵化，平均水温为（1.5±0.8）℃，平均溶氧量为（10.7±2.0）mg/L。每个试验组设5个重复。对每个孵化瓶中的活卵和死卵进行计数。根据以下公式求出受精率：
受精率（%）=原肠期以上的活卵总数/总卵子数×100
1.3 数据分析方法
采用统计软件SPSS 17.0 One-Way ANOVA进行数据处理，并分析其差异显著性，个别数据处理在文中另行标明。
2 结果与分析
2.1 不同浓度甘油冷冻保护剂对七彩鲑受精率的影响
使用5%～30%浓度梯度的甘油，冷冻保存七彩鲑精液7 d后解冻，进行七彩鲑人工繁殖试验，受精率结果见表1。试验结果表明，20%浓度甘油组的受精率达到了51.08%～61.56%，该受精率显著高于其他浓度甘油组的受精率。
2.2 不同冷冻麦管规格对七彩鲑受精率的影响
试验结果表明，0.5 mL麦管组的受精率均高于1.8 mL（下转第296页）
（上接第293页）
麦管组的受精率，但该差异在5%、15%、30%浓度甘油组的组内不显著，而在20%、25%浓度甘油组的组内差异显著，其中在20%浓度甘油组中的0.5 mL麦管组，平均受精率达到61.38%，为该次试验的最高值（表1）。
3 结论与讨论
鱼类精液冷冻保存技术不但可以通过建立优良养殖鱼类或濒危鱼类的冷冻精子库、细胞库或胚胎库进行种质保护，为鱼类遗传育种和生物技术研究提供材料，还可以实现不同生殖期或地理间隔的鱼类进行交配，解决雌、雄鱼成熟不同步的问题。这项技术的主要环节包括保护剂的选择、降温平衡、麦管选择以及冷冻精液的解冻等过程[3]。
甘油作为冷冻保护剂应用到水产动物的精液冷冻保存上已有许多报道，如徐海龙等[4]在高体革鯻的精液冷冻中，陈亚坤[5]在真鲷精子超低温保存当中均用到了不同浓度的甘油作精液保护剂。本试验证实以20%甘油作为精液冷冻保护剂在七彩鲑的人工受精试验中可获得比较理想的试验效果。这与Piironen[6]在1983年对穆松白鲑（Coregonus muksun）精液稀释保护液的筛选试验结果一致。
目前在水产动物精液冷冻保存研究过程中，在麦管规格的选择上一般范围为0.1～5.0 mL。各规格的麦管在精液冷冻保存方面有着各自的优点和缺点，规格小的麦管在冷冻保存过程当中，由于直径偏小，不容易形成冰凌，冷冻效果比较好，但冷冻保存的精液数量有限；规格偏大的麦管在冷冻保存过程中，由于直径偏大，容易形成冰凌，对精子内部结构造成损伤，造成精子死亡，从而影响冷冻效果，但冷冻保存的精液数量较大。Lahnsteiner等[7]在对虹鳟、河鳟等几种鲑科鱼类的研究中表明，1.2 mL麦管能得到与0.5 mL麦管相似的受精率，而5 mL麦管却只有40%的受精率。本研究证实，用0.5 mL麦管冷冻保存七彩鲑精液的受精率达到了61.38%，显著高于1.8 mL麦管，这一结果与Lahnsteiner等对虹鳟和河鳟的精液冷冻保存研究结果一致。
4 参考文献
[1] 任伟，柳相玺.鲑鳟鱼类养殖技术之五 七彩鲑鱼人工孵化及苗种培育技术[J].中国水产，2008（2）：39-40.
[2] 刘建平，梁桂英，陈志伟.冰水女皇——七彩鲑鱼[J].科学养鱼，2002（2）：58.
[3] 张旭.西北山区河水养殖鲑鳟技术[J].中国水产，2005（8）：40-41.
[4] 徐海龙，张桂芬，朱永安，等.高体革鯻精子超低温保存方法研究[J].安徽农业科学，2010（6）：2974-2976.
[5] 陈亚坤.超低温保存对真鲷（Pagrus major）精子质量的影响[D].青岛：中国科学院海洋研究所，2010.
[6] PIIRONEN J.Factor affecting fertilization rate with cryopreserved sperm of white fish（Coregonus muksun Pallas）[J].Aquacuture，1987（66）：347-357.
[7] LAHNSTEINER F，WEISMANN T，PATZNER R A.Fine structural chan-ges in spermatozoa of the grayling，Thymallus thymallus（Pisces：Teleost-ei），during routinecryopreservation[J].Aquaculture，1992（103）：73-84.
关键词 甘油；冷冻保护剂；冷冻麦管；七彩鲑；受精率；影响
中图分类号 S961.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）01-0293-01
Effects of Different Concentrations of Glycerol as Cryoprotectant and Different Sizes of Straw on
Fertilization Rate of Salvelinus fontinalis
DENG Shuang-yi LI Sheng-zhong CHENG Pei GUAN Xiu-zhi
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi Xinjiang 830052）
Abstract The artificial fertilization experiment on Salvelinus fontinalis was carried out，using 5%～30% glycerol as cryoprotectant，and 0.5 mL and 1.8 mL straw as semen cryopreservation container. The results showed that：The fertilization rates of 20% glycerol group reached 51.08%～61.56%，which was obviously higher than other concentrations of glycerol groups. With the glycerol concentration of 20%～25%，the fertilization rates of 0.5 mL straw group were significantly higher than the fertilization rates of 1.8 mL straw group. The mean fertilization rate of 20% glycerol and 0.5 mL straw group was the highest，which reached 61.38%.
Key words glycerol；cryoprotectant；straw；Salvelinus fontinalis；fertilization rate；effect
七彩鲑（Salvelinus fontinalis）又名溪鳟，学名美洲红点鲑，属于鲑科红点鲑属，分布于加拿大东部的拉布拉多地区以及美国大西洋沿岸、五大湖与密西西比河流域、明尼苏达州和乔治亚洲北部。七彩鲑鱼色彩鲜艳，体表布满蚯蚓状的橄榄绿色花纹，胭脂色的红点镶嵌在多个天蓝的圆环中，鳞片细小，每个鳍翅下沿都有1条奶白的裙边，这是七彩鲑与其他鲑鳟的主要区别[1]。七彩鲑是鲑鱼中体形最小的一种，体重一般不超过2 kg[2]。七彩鲑对环境的变化具有极强的适应性，对温度和酸碱度的急剧变化具有很强的适应能力。尤其是对酸碱度的适应能力强，其pH值适应范围在4.8～9.8，最低可达3.5。因此，在酸度很高的水体中，七彩鲑鱼可能是唯一可以存活的冷水鱼种。另外，七彩鲑食性杂，易驯化，易饲养。为了解决七彩鲑人工繁殖过程中，雌雄亲鱼性成熟不匹配的问题，满足七彩鲑优良品种的保护和育种的需要，特开展七彩鲑精子活力调控和冷冻保存的研究。旨在探讨甘油作为冷冻保护剂对七彩鲑受精率的影响，为七彩鲑的人工繁殖提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用亲鱼来自新疆温泉县冷水鱼繁育中心，其中雌性亲鱼10尾，雄性亲鱼5尾，其平均体长分别为（38.0±2.0） cm和（36.0±3.5） cm，体重1.5～2.0 kg。供试试剂为甘油、液氮。主要仪器为液氮罐、维萨斯孵化瓶、常规手术用具等。
1.2 试验方法
1.2.1 精液稀释液的配制。分别以5%、15%、20%、25%、30%的甘油作为冷冻保护剂，配制出5种不同的精液保护液。
1.2.2 精液的采集与处理。采精前先把雄鱼体表的水用毛巾擦干，然后用手挤压雄鱼腹部，将精液挤入干燥小烧杯中，整个过程要防止精液接触水分，将5尾雄鱼精液混合，置于冰盒内，避光储存待用。对精液进行冷冻保存。将精液与上述各个浓度梯度的甘油按照1∶3的比例进行混合，然后分别吸入0.5 mL麦管和1.8 mL麦管中，密封后置于液氮槽的液氮表面上1.5 cm处，逐步降温，5 min后将麦管快速转入液氮中，10 min后将麦管放入液氮罐冷冻保存。
1.2.3 卵子的采集与保存。取性腺发育成熟的雌鱼，用毛巾将鱼体，特别是腹部擦拭干净，轻轻挤压雌鱼腹部，将鱼卵沿杯壁挤入烧杯中，避光储存待用。
1.2.4 人工授精与受精卵孵化。将冷冻保存7 d的精液取出，在30 ℃水浴中解冻30 s，然后取100 μL的冻精迅速倒入4.6 g的卵子中（精子与卵子比例约为0.4×106∶1），同时加入占卵子体积50%的养殖池水，迅速混匀，静置1～2 min后洗卵。受精卵的孵化在新疆温泉县冷水鱼繁育中心进行。采用维萨斯孵化瓶孵化，平均水温为（1.5±0.8）℃，平均溶氧量为（10.7±2.0）mg/L。每个试验组设5个重复。对每个孵化瓶中的活卵和死卵进行计数。根据以下公式求出受精率：
受精率（%）=原肠期以上的活卵总数/总卵子数×100
1.3 数据分析方法
采用统计软件SPSS 17.0 One-Way ANOVA进行数据处理，并分析其差异显著性，个别数据处理在文中另行标明。
2 结果与分析
2.1 不同浓度甘油冷冻保护剂对七彩鲑受精率的影响
使用5%～30%浓度梯度的甘油，冷冻保存七彩鲑精液7 d后解冻，进行七彩鲑人工繁殖试验，受精率结果见表1。试验结果表明，20%浓度甘油组的受精率达到了51.08%～61.56%，该受精率显著高于其他浓度甘油组的受精率。
2.2 不同冷冻麦管规格对七彩鲑受精率的影响
试验结果表明，0.5 mL麦管组的受精率均高于1.8 mL（下转第296页）
（上接第293页）
麦管组的受精率，但该差异在5%、15%、30%浓度甘油组的组内不显著，而在20%、25%浓度甘油组的组内差异显著，其中在20%浓度甘油组中的0.5 mL麦管组，平均受精率达到61.38%，为该次试验的最高值（表1）。
3 结论与讨论
鱼类精液冷冻保存技术不但可以通过建立优良养殖鱼类或濒危鱼类的冷冻精子库、细胞库或胚胎库进行种质保护，为鱼类遗传育种和生物技术研究提供材料，还可以实现不同生殖期或地理间隔的鱼类进行交配，解决雌、雄鱼成熟不同步的问题。这项技术的主要环节包括保护剂的选择、降温平衡、麦管选择以及冷冻精液的解冻等过程[3]。
甘油作为冷冻保护剂应用到水产动物的精液冷冻保存上已有许多报道，如徐海龙等[4]在高体革鯻的精液冷冻中，陈亚坤[5]在真鲷精子超低温保存当中均用到了不同浓度的甘油作精液保护剂。本试验证实以20%甘油作为精液冷冻保护剂在七彩鲑的人工受精试验中可获得比较理想的试验效果。这与Piironen[6]在1983年对穆松白鲑（Coregonus muksun）精液稀释保护液的筛选试验结果一致。
目前在水产动物精液冷冻保存研究过程中，在麦管规格的选择上一般范围为0.1～5.0 mL。各规格的麦管在精液冷冻保存方面有着各自的优点和缺点，规格小的麦管在冷冻保存过程当中，由于直径偏小，不容易形成冰凌，冷冻效果比较好，但冷冻保存的精液数量有限；规格偏大的麦管在冷冻保存过程中，由于直径偏大，容易形成冰凌，对精子内部结构造成损伤，造成精子死亡，从而影响冷冻效果，但冷冻保存的精液数量较大。Lahnsteiner等[7]在对虹鳟、河鳟等几种鲑科鱼类的研究中表明，1.2 mL麦管能得到与0.5 mL麦管相似的受精率，而5 mL麦管却只有40%的受精率。本研究证实，用0.5 mL麦管冷冻保存七彩鲑精液的受精率达到了61.38%，显著高于1.8 mL麦管，这一结果与Lahnsteiner等对虹鳟和河鳟的精液冷冻保存研究结果一致。
4 参考文献
[1] 任伟，柳相玺.鲑鳟鱼类养殖技术之五 七彩鲑鱼人工孵化及苗种培育技术[J].中国水产，2008（2）：39-40.
[2] 刘建平，梁桂英，陈志伟.冰水女皇——七彩鲑鱼[J].科学养鱼，2002（2）：58.
[3] 张旭.西北山区河水养殖鲑鳟技术[J].中国水产，2005（8）：40-41.
[4] 徐海龙，张桂芬，朱永安，等.高体革鯻精子超低温保存方法研究[J].安徽农业科学，2010（6）：2974-2976.
[5] 陈亚坤.超低温保存对真鲷（Pagrus major）精子质量的影响[D].青岛：中国科学院海洋研究所，2010.
[6] PIIRONEN J.Factor affecting fertilization rate with cryopreserved sperm of white fish（Coregonus muksun Pallas）[J].Aquacuture，1987（66）：347-357.
[7] LAHNSTEINER F，WEISMANN T，PATZNER R A.Fine structural chan-ges in spermatozoa of the grayling，Thymallus thymallus（Pisces：Teleost-ei），during routinecryopreservation[J].Aquaculture，1992（103）：73-84.