论文部分内容阅读
目的
构建Nicastrin（NCT）基因的RNA干扰慢病毒表达载体，并在人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）上鉴定其沉默效率，构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型，为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础。
方法设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA（shRNA）表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H1/GFP+ Puro中，成功构建慢病毒重组表达质粒，并通过测序鉴定。将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞，产生慢病毒颗粒，并测其滴度。将HaCaT细胞分为空白组（未感染病毒）、阴性对照组（NC组，感染空载病毒LV3-shNC）和干扰组（感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒）。流式细胞仪检测慢病毒转染效率，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹检测靶基因的沉默效率，筛选出沉默效果最佳的干扰序列。
结果测序表明，NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功。重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml。慢病毒感染HaCaT细胞后，流式细胞仪检测，慢病毒转染效率大于95%。qRT-PCR结果，与NC组相比，干扰组NCT mRNA表达量明显下降，其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳，干扰效率达到75%。Western印迹结果，与NC组相比，shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7%。
结论成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列，构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体，并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型。