【摘 要】
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目的:构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体, 并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达.方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因, Sac I/Not I双酶切后插入真核表达载体pCE
【机 构】
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第四军医大学基础部细胞生物学教研室暨细胞工程研究中心,比利时根特大学医学系医用蛋白研究室
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目的:构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体, 并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达.方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因, Sac I/Not I双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中, 构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEF, 并经酶切和测序验证.将此重组表达载体与POG44载体(按1∶9的比例混合后), 在阳离子脂质体介导下共转染HEK293-16工程细胞, 用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF cDNA的细胞克隆.用间接免疫荧光染色法、流式细胞术及Zeocin致死试验, 检测并验证稳定表达株中EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的表达.结果:成功地构建pCEL2f/HAb18GEF真核重组表达载体, 共转染后EpoR、 HAb18GEF均高效表达于转染的HEK293-16细胞的胞膜上.经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF的稳定株, 其表达EpoR的阳性率为99.93%, 平均荧光强度(MFI)为1036.39, 表达HAb18GEF的阳性率为99.51%, MFI为652.72, 且可被Zeocin致死.结论:成功地建立了表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的HEK293-16工程细胞株, 为进一步利用哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱(MAPPIT)系统筛选HAb18G的作用受体奠定了基础.
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