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【摘 要】 变形链球菌是龋病的主要致病菌，氟化物是目前应用最广泛的防龋制剂，然而，氟化物的广泛应用可能导致变形链球菌耐氟菌株的出现（1）。随着现代口腔医学和分子生物学的发展，耐氟菌株耐酸相关基因的研究也越来越多，发现了许多与之相关的基因。对耐氟菌株耐酸相关基因的研究可以更深入地了解其致龋机制，并对寻找防龋新途径作出有益的探索。本文变形链球菌耐氟菌株耐酸相关的基因突变研究作一综述。
【关键词】 变形链球菌 耐氟菌株
变形链球菌在龋病的发生和发展中起重要作用，其致龋性与其耐酸性密切相关。研究表明变形链球菌的耐酸性与质子移位膜ATP酶的活性和最适pH值有关， ATP酶的活性越大、最适pH值越低，则其在酸性环境中排除多余H+的能力越强，因而越耐酸。氟化物是目前應用最广泛的防龋制剂，多种氟化物制剂的广泛使用， 导致耐氟菌株的选择性生长[1] 耐氟菌株的出现为氟化物防龋提出了新的问题。耐氟菌株不仅能降低局部用氟所产生的抑龋效果，而且较亲代菌株更不易被氟化物所抑制，具有更强的致龋性。
变形链球菌耐氟菌株依菌株的不同，pH条件的不同而致龋性各异，在很多情况下，其致龋力大于亲代株。Van Loverne学者（2）发现在pH>6.0时，耐氟突变株的产酸速度低于亲代野生株，而在pH为5.5到5.0时耐氟突变株的产酸速度则高于亲代野生株，耐氟菌株也较亲代野生株有更强的氟耐受力。这说明一旦牙菌斑中的pH下降至5.5或更低，其中的耐氟菌株将具有更强的致龋性。对变形链球菌耐氟突变后基因型改变的研究有助于探讨耐氟菌株产生的可能机理，揭示其致龋性增强的原因，为临床合理用氟和进一步防龋提供试验依据。
Chansley（3）在研究变形链球菌氟耐受的性质时，将从变形链球菌Gs-5的耐氟突变型中提取的DNA转移到同一菌株的氟敏感细胞内，产生了耐氟的菌株，而且氟耐受水平在DNA供体的耐受范围内。从中我们可以推测变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株生物学特征不同的原因可能是由于基因型的改变所致。盛江筠应用细菌DNA碱基组成分析的方法，即DNA中鸟嗓吟（G）和胞嘧啶（C）的含量测定，发现变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株已发生基因型改变，且可能包括多个基因的突变（4）。朱怡玲等（5）利用限制性内切酶对变异链球菌的DNA进行切割，经琼脂糖凝胶电泳，获得其独特的特征性“基因组指纹”图谱，经比较发现这些图谱上的带型有所不同，提示耐氟菌株的基因组已发生改变，具有自身的遗传特性。
1 ffh，fhs，dfp
Gutierrez（6）等用转座因子Tn917插入诱变变链菌野生株JH1005，产生对酸有不同程度敏感性的突变株As17，As5和As25。克隆、测序并分析其被插入片段，发现了3个与耐酸性相关的基因。
对酸高度敏感的AS17株，其Tn917插入区被命名为sat，ffh突变产生耐酸性缺陷株，表明ffh突变影响了变链菌的耐酸性。缺乏ffh基因的突变株只具有亲代26%-39%的质子移位膜腺苷三磷酸酶（F-ATPase）活性和55%-75%的葡萄糖磷酸转移酶活性。张志民（7）等对变形链球菌耐氟菌株进行提取细菌基因组，设计引物进行PCR，构建重组质粒，酶切电泳，测序鉴定。经BLASTN 比对与 GenBank 报告序列不同， 有13 个碱基发生突变，结果呈送 GenBank，登录序列号为AY857409。
对酸中度敏感的AS5株，其被插入片段与fhs基因有高度一致性（6）.由于ATP是质子移位膜腺苷三磷酸酶的作用底物，推测fhs突变导致耐酸性缺陷的原因是嘌呤合成障碍引起ATP合成不足（8）。张志民（7）课题组对耐酸相关基因 fhs进行了检测发现fhs基因发生了突变，检测结果登陆美国 GenBank，序列号为 EF405868。此序列经 BLASTN 比对与 GenBank报告序列不同，有 6 个碱基发生突变，突变均属于点突变， 突变具体部位也已确定。其中有 2 个突变位点即 155（G→A）和 913（G→A）的突变导致了密码子所编码氨基酸的变化，即引起了错义突变，分别为精氨酸→谷氨酰胺和缬氨酸→异亮氨酸，关于该突变能否引起变形链球菌耐氟菌株耐酸性增强目前还不清楚。
显示弱的酸敏感性的AS25株，其被插入片段与dfp基因有较大同源性（8）。张志民等对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dfp进行了检测，发现耐酸相关基因dfp基因未发生突变。
2 dgk
Yamashita（9）等研究变链菌突变株对环境应激改变的分子机制时发现，转座因子Tn916的单一插入可导致变链菌野生株GS-5对酸性pH值敏感。张志民（10）等对耐酸相关基因 dgk进行了检测发现dgk基因发生了点突变，突变点均位于密码子的第3位碱基，均不改变所编码的蛋白，属于同义突变。
3 dnak
Jayaraman（11）等发现，dnaK与位于其一前方的hrcA和grpE基因共同构成一个操纵子样排列.张志民等对耐酸相关基因 dnak进行了检测发现dnak基因发生了突变，检测发现此序列有3个碱基发生突变，突变位点分别在 513（T→G），1029（T→A），1172（T→C）。
4 dltc
口腔链球菌的dlt操纵子包含4个基因：dltA，dltB，dltC，dltD，其中dltC编码。D-丙氨酰基载体蛋白（Dcp）。Boyd（12）等通过失活变链菌野生株LTll的dltC基因构建了突变株BH97LC。与LT11相比，BH97LC不仅对酸敏感、耐酸反应性缺陷，而且对质子的通透性增强。张志民等（13）对耐酸相关基因dltC进行了检测发现dltC 基因有 1个碱基发生突变， 突变位点在 8310（ A→G ）。提交该序列到 GenBank， 获得登陆序列号为 DQ272518。该突变是点突变并属于同义突变。 5 gluA
Yamashita[9]等发现变链菌gluA基因失活所形成的突变体的耐酸性明显降低。郑鹏等对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因gluA进行了检测，发现gluA基因未发生突变。
当今的科学是多学科相交融的，一个学科的发展必将带动相关学科的进步。随着人类基因组计划的胜利完成，基因组学和后基因组学的理念和技术已渗透到生命科学的各个领域，同样也为人类主要致龋菌变形链球菌耐氟菌株的研究提供了条件，必将使该菌的致病机制更加明确，新的生物工程技术将成为更有效合理的防治龋病的措施。对耐氟菌株耐酸相关基因的研究可以更深入地了解其致龋机制，并对寻找防龋新途径作出有益的探索，并且有助于探讨耐氟菌株产生的可能机理，揭示其致龋性增强的原因，为临床合理用氟和进一步防龋提供试验依据。
参考文献
[1]Chansley PE， Kral TA.Transformation of fluoride resistance genes in Streptococcus mutans[J]. Infect Immun， 1989， 57： 1968-1970.
[2]Van Loveren C，van de Plassche-SimonsYM，De SoetJJ，et al.Acidogenesis in relation to fluoride resistnace of StrePtococcus mutnas.Oral[J] Microbiol Immunol.1991，otc6（5）：288一291.
[3]Chansley PE，Kral TA.Transformation of fluoride resistance genes in strePto-coccusmutans[J].Infect Immun，1989，57（7）：1968一1970.
[4]盛江筠，刘正.变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株DNA G+C含量测定[J].上海口腔医学2001，10（1）：49一51
[5]朱怡玲，吴补领，孟艳玲，等。 变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组AP-PCR的比较[J]。牙体牙髓牙周病学杂志，2004，14（7）：382-385.
[6]Kremer BHA，Kraan M，Crowley PJ et al.Characterization of the sat Operon in Streptococcus mutans：Evidence for a Role of ffh in Acid Tolerance.[J] Bacteriol，2001，183（8）：2543一2552.
[7]張志民，赵洪岩，张家颖. 变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh突变的检测[J].现代口腔医学杂志， 2001，21（6）：570-572.
[8]Crowley PJ，Cutierrez JA，Hillman JD， et al. Genetic and Physiologic Analysis of a Formyl-TetrahydrofolateSynthetase Mutant of Streptococcus mutans.J Bacrerial，1997，179（5）：1563-1572.
[9]Yamashita Y，Takehara T，Kuramitsu HK.Molecular charaeterization of a StrePtococcus mutans mutant altered in environmental stress responses.J Bacteriol，1993，175（19）：6220一6228.
[10]张志民，任宝华，张家颖，等.变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义[J].吉林大学学报：医学版， 2008，34（5）：850-853.
[11]Jayaraman GC，Penders JE，Bume RA.Transcriptional analysis of the Streptococcus mutans hrcA，grpE and dnaK genes and regulation of expression in response to heat shock and environment acidification.Mol Microbiol，1997，25（2）：329一341.
[12]Boyd DA，Cvitkovitch DG，Bleiweis AS et al.Defects in D-alanyl-liPoteichoic acid synthesis in StrePtococcus mutans results in acid sensitivity.J Bacteriol，2000，182（21）： 6055一6065.
[13]张志民， 任宝华， 张家颖，等。变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因 dltC突变的检测及临床意义[J].口腔生物医学，2010，3（11）：22-24.
【关键词】 变形链球菌 耐氟菌株
变形链球菌在龋病的发生和发展中起重要作用，其致龋性与其耐酸性密切相关。研究表明变形链球菌的耐酸性与质子移位膜ATP酶的活性和最适pH值有关， ATP酶的活性越大、最适pH值越低，则其在酸性环境中排除多余H+的能力越强，因而越耐酸。氟化物是目前應用最广泛的防龋制剂，多种氟化物制剂的广泛使用， 导致耐氟菌株的选择性生长[1] 耐氟菌株的出现为氟化物防龋提出了新的问题。耐氟菌株不仅能降低局部用氟所产生的抑龋效果，而且较亲代菌株更不易被氟化物所抑制，具有更强的致龋性。
变形链球菌耐氟菌株依菌株的不同，pH条件的不同而致龋性各异，在很多情况下，其致龋力大于亲代株。Van Loverne学者（2）发现在pH>6.0时，耐氟突变株的产酸速度低于亲代野生株，而在pH为5.5到5.0时耐氟突变株的产酸速度则高于亲代野生株，耐氟菌株也较亲代野生株有更强的氟耐受力。这说明一旦牙菌斑中的pH下降至5.5或更低，其中的耐氟菌株将具有更强的致龋性。对变形链球菌耐氟突变后基因型改变的研究有助于探讨耐氟菌株产生的可能机理，揭示其致龋性增强的原因，为临床合理用氟和进一步防龋提供试验依据。
Chansley（3）在研究变形链球菌氟耐受的性质时，将从变形链球菌Gs-5的耐氟突变型中提取的DNA转移到同一菌株的氟敏感细胞内，产生了耐氟的菌株，而且氟耐受水平在DNA供体的耐受范围内。从中我们可以推测变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株生物学特征不同的原因可能是由于基因型的改变所致。盛江筠应用细菌DNA碱基组成分析的方法，即DNA中鸟嗓吟（G）和胞嘧啶（C）的含量测定，发现变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株已发生基因型改变，且可能包括多个基因的突变（4）。朱怡玲等（5）利用限制性内切酶对变异链球菌的DNA进行切割，经琼脂糖凝胶电泳，获得其独特的特征性“基因组指纹”图谱，经比较发现这些图谱上的带型有所不同，提示耐氟菌株的基因组已发生改变，具有自身的遗传特性。
1 ffh，fhs，dfp
Gutierrez（6）等用转座因子Tn917插入诱变变链菌野生株JH1005，产生对酸有不同程度敏感性的突变株As17，As5和As25。克隆、测序并分析其被插入片段，发现了3个与耐酸性相关的基因。
对酸高度敏感的AS17株，其Tn917插入区被命名为sat，ffh突变产生耐酸性缺陷株，表明ffh突变影响了变链菌的耐酸性。缺乏ffh基因的突变株只具有亲代26%-39%的质子移位膜腺苷三磷酸酶（F-ATPase）活性和55%-75%的葡萄糖磷酸转移酶活性。张志民（7）等对变形链球菌耐氟菌株进行提取细菌基因组，设计引物进行PCR，构建重组质粒，酶切电泳，测序鉴定。经BLASTN 比对与 GenBank 报告序列不同， 有13 个碱基发生突变，结果呈送 GenBank，登录序列号为AY857409。
对酸中度敏感的AS5株，其被插入片段与fhs基因有高度一致性（6）.由于ATP是质子移位膜腺苷三磷酸酶的作用底物，推测fhs突变导致耐酸性缺陷的原因是嘌呤合成障碍引起ATP合成不足（8）。张志民（7）课题组对耐酸相关基因 fhs进行了检测发现fhs基因发生了突变，检测结果登陆美国 GenBank，序列号为 EF405868。此序列经 BLASTN 比对与 GenBank报告序列不同，有 6 个碱基发生突变，突变均属于点突变， 突变具体部位也已确定。其中有 2 个突变位点即 155（G→A）和 913（G→A）的突变导致了密码子所编码氨基酸的变化，即引起了错义突变，分别为精氨酸→谷氨酰胺和缬氨酸→异亮氨酸，关于该突变能否引起变形链球菌耐氟菌株耐酸性增强目前还不清楚。
显示弱的酸敏感性的AS25株，其被插入片段与dfp基因有较大同源性（8）。张志民等对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dfp进行了检测，发现耐酸相关基因dfp基因未发生突变。
2 dgk
Yamashita（9）等研究变链菌突变株对环境应激改变的分子机制时发现，转座因子Tn916的单一插入可导致变链菌野生株GS-5对酸性pH值敏感。张志民（10）等对耐酸相关基因 dgk进行了检测发现dgk基因发生了点突变，突变点均位于密码子的第3位碱基，均不改变所编码的蛋白，属于同义突变。
3 dnak
Jayaraman（11）等发现，dnaK与位于其一前方的hrcA和grpE基因共同构成一个操纵子样排列.张志民等对耐酸相关基因 dnak进行了检测发现dnak基因发生了突变，检测发现此序列有3个碱基发生突变，突变位点分别在 513（T→G），1029（T→A），1172（T→C）。
4 dltc
口腔链球菌的dlt操纵子包含4个基因：dltA，dltB，dltC，dltD，其中dltC编码。D-丙氨酰基载体蛋白（Dcp）。Boyd（12）等通过失活变链菌野生株LTll的dltC基因构建了突变株BH97LC。与LT11相比，BH97LC不仅对酸敏感、耐酸反应性缺陷，而且对质子的通透性增强。张志民等（13）对耐酸相关基因dltC进行了检测发现dltC 基因有 1个碱基发生突变， 突变位点在 8310（ A→G ）。提交该序列到 GenBank， 获得登陆序列号为 DQ272518。该突变是点突变并属于同义突变。 5 gluA
Yamashita[9]等发现变链菌gluA基因失活所形成的突变体的耐酸性明显降低。郑鹏等对变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因gluA进行了检测，发现gluA基因未发生突变。
当今的科学是多学科相交融的，一个学科的发展必将带动相关学科的进步。随着人类基因组计划的胜利完成，基因组学和后基因组学的理念和技术已渗透到生命科学的各个领域，同样也为人类主要致龋菌变形链球菌耐氟菌株的研究提供了条件，必将使该菌的致病机制更加明确，新的生物工程技术将成为更有效合理的防治龋病的措施。对耐氟菌株耐酸相关基因的研究可以更深入地了解其致龋机制，并对寻找防龋新途径作出有益的探索，并且有助于探讨耐氟菌株产生的可能机理，揭示其致龋性增强的原因，为临床合理用氟和进一步防龋提供试验依据。
参考文献
[1]Chansley PE， Kral TA.Transformation of fluoride resistance genes in Streptococcus mutans[J]. Infect Immun， 1989， 57： 1968-1970.
[2]Van Loveren C，van de Plassche-SimonsYM，De SoetJJ，et al.Acidogenesis in relation to fluoride resistnace of StrePtococcus mutnas.Oral[J] Microbiol Immunol.1991，otc6（5）：288一291.
[3]Chansley PE，Kral TA.Transformation of fluoride resistance genes in strePto-coccusmutans[J].Infect Immun，1989，57（7）：1968一1970.
[4]盛江筠，刘正.变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株DNA G+C含量测定[J].上海口腔医学2001，10（1）：49一51
[5]朱怡玲，吴补领，孟艳玲，等。 变形链球菌耐氟菌株、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组AP-PCR的比较[J]。牙体牙髓牙周病学杂志，2004，14（7）：382-385.
[6]Kremer BHA，Kraan M，Crowley PJ et al.Characterization of the sat Operon in Streptococcus mutans：Evidence for a Role of ffh in Acid Tolerance.[J] Bacteriol，2001，183（8）：2543一2552.
[7]張志民，赵洪岩，张家颖. 变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因ffh突变的检测[J].现代口腔医学杂志， 2001，21（6）：570-572.
[8]Crowley PJ，Cutierrez JA，Hillman JD， et al. Genetic and Physiologic Analysis of a Formyl-TetrahydrofolateSynthetase Mutant of Streptococcus mutans.J Bacrerial，1997，179（5）：1563-1572.
[9]Yamashita Y，Takehara T，Kuramitsu HK.Molecular charaeterization of a StrePtococcus mutans mutant altered in environmental stress responses.J Bacteriol，1993，175（19）：6220一6228.
[10]张志民，任宝华，张家颖，等.变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义[J].吉林大学学报：医学版， 2008，34（5）：850-853.
[11]Jayaraman GC，Penders JE，Bume RA.Transcriptional analysis of the Streptococcus mutans hrcA，grpE and dnaK genes and regulation of expression in response to heat shock and environment acidification.Mol Microbiol，1997，25（2）：329一341.
[12]Boyd DA，Cvitkovitch DG，Bleiweis AS et al.Defects in D-alanyl-liPoteichoic acid synthesis in StrePtococcus mutans results in acid sensitivity.J Bacteriol，2000，182（21）： 6055一6065.
[13]张志民， 任宝华， 张家颖，等。变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因 dltC突变的检测及临床意义[J].口腔生物医学，2010，3（11）：22-24.