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摘 要：狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的烈性传染病。本试验通过实时荧光定量PCR技术对一例疑似人感染狂犬病病毒的病例分7个时段采集其尿液及唾液标本进行实验室检测。结果显示，7个唾液样本狂犬病病毒均为阳性，7个尿液样本中5个样本为阳性，2个样本为阴性，唾液样本Ct值明显优于尿液样本。本试验对实时荧光定量PCR技术应用到临床检测狂犬病病毒具有重要的参考价值。
关键词：狂犬病病毒;实时荧光定量PCR;检测
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1004-7344（2019）03-0272-02
狂犬病（rabies）是由狂犬病毒（rabiesvirus，RABV）所致的人兽共患急性传染病，发病后死亡率接近100%。全球每年约有5.5万人死于狂犬病，我国是狂犬病高发地区，因感染狂犬病死亡的人数居世界第二[1]。在我国，狂犬病是国家重点防控的乙类传染病。近年来，由于我国养犬、猫等宠物的家庭日渐增多，该病的发病率呈上升趋势[2]。据中国疾病预防控制中心2017年的最新统计，2017年全国狂犬病发病数为516人，死亡502人。
狂犬病毒属于弹状病毒（Rhabdoviridae）狂犬病毒属，是单股负链RNA病毒，基因组长度为11928～11932nt，编码5种蛋白结构，5种蛋白对应5种结构基因编码，其中N基因具有毒株间的相对保守性和高拷贝复制性，是分子诊断的目标序列[3]。近年来，随着分子生物技术的迅猛发展，核酸诊断技术被应用到狂犬病的诊断中。实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）是基于传统PCR上发展起来的新技术，具有实时监测核算拷贝数量、灵敏度高、检测速度快等优点，被广泛应用于病毒性病原体的快速检测中[4]。目前，国内鲜有采用实时荧光定量PCR技术对人体感染狂犬病病毒样本进行检测的报道。本试验通过实时荧光定量PCR技术对一例人感染狂犬病病毒的病例进行取样检测，旨在为实时荧光定量PCR技术应用到临床检测狂犬病病毒提供参考。
1 材料与方法
1.1 标本信息
患者刘某，男，53岁，重庆市潼南区人。该患者于2018年7月被犬咬伤手臂，暴露程度Ⅲ度，伤口未处理。刘某于2018年11月28日出现烦躁、恐水、怕风、抽出等症状，并于12月1日入院。2018年12月3日晚间19点至4日早上7点期间，时隔2h对患者中段尿及唾液进行采集，共计14个样本（1～7号为尿液样本，8～14号为唾液样本），采集后的样品于-20℃下保存。
1.2 试剂与仪器
病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）和狂犬病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）均购自江苏硕世生物科技有限公司，Real-TimePCRSystem（stepone），全自动核酸提取仪（SSNP-2000A）。
1.3 方 法
1.3.1 核酸提取
将样品于室温条件下融冻，向病毒核酸提取试剂盒对应孔位分别加入样品200μl，置于全自动核酸提取仪中进行核酸提取，具体操作见说明书。提取完成后吸出样品核酸于保存管中，-20℃下保存。
1.3.2 实时荧光定量PCR反应
①反应体系：每人份PT-PCR反应液7.5μl，酶混合液5μl，狂犬病反应液4μl，去RNA酶水3.5μl，样品5μl，总体积25μl。②反应条件：逆转录反应50℃30min，预变性95℃5min，变性95℃10s，退火、延伸及检测荧光55℃40s45个循环。
1.3.3 结果判定方法
（1）阳性对照：Ct≤30且扩增曲线呈典型S型显示。
（2）阴性对照：无典型S型扩增曲线显示。
（3）样本阳性：Ct≤35且曲线呈S型。若样本检测结果35 （4）样本阴性：Ct>38或者未检出。
2 结 果
2.1 实时荧光PCR对尿液样品检测结果
对7个时段采集的病人中段尿样品进行实时荧光定量PCR检测，结果见图1，由图可知2号和6号样本为阴性，其余样本实时荧光定量PCR的Ct值分别为1号：35.68，3号：35.77，4号：36.63，5号：36.12，7号：35.92。
2.2 实时荧光PCR对唾液样品检测结果
对7个时段采集的病人唾液样品进行实时荧光定量PCR检测，结果见图2，由图可知7个唾液样本均含有狂犬病病毒，各样本实时荧光定量PCR的Ct值分别为8号：30.12，9号：31.22，10号：30.91，11號31.75，12号：29.33，13号：29.89：14号29.78。
3 讨 论
本试验采用实时荧光定量PCR方法对以一例真实发病的病人7个时段唾液及尿液为样本进行检测。由结果可知尿液样本中2号和6号样本结果为阴性，其余时段尿液均有病毒检出，而7个唾液样本所有时均为阳性，且曲线的CT值明显优于尿液样本。这是由于狂犬病的最主要传染源是发病和携带病毒的动物，这些动物的唾液中含有大量病毒[5]，并通过咬伤、抓伤进行传染，因此唾液样本的病毒含量远高于尿液样本。而狂犬病毒的分泌量由一定的波动性[6]，因此在尿液样本中出现两个阴性。
目前，对狂犬病毒的实验室诊断方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体技术（FAT）、环介导等温扩增技术（LAMP）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）等。目前FAT技术是WHO和OIE推荐的黄金标准方法，但此方法需要异硫氰酸荧光素盐为荧光标记物标记抗体以定位抗原，同时还需要使用荧光显微镜，操作较繁琐，对试验操作人员专业素质要求较高。实时荧光定量PCR技术以其快速、灵敏、重复性好的特点已被广泛应用于高通量的病毒检测，目前，国内外已经应用这一技术建立了多种检测RABV的荧光定量PCR方法，针对我国狂犬病的流行特征，许运斌[7]等均成功合成引物和探针建立了荧光定量PCR检测RABV的方法。但实时荧光定量PCR技术在试验过程中容易造成样本的污染导致假阳性的出现，这一情况有待进一步研究改善。
狂犬病是一种严重危害人类生命安全的疫病，急需一种快速、准确、灵敏的诊断方法。本试验通过实时荧光定量PCR检测了一例人感染狂犬病病毒的尿液及唾液样本，一定程度上填补了国内使用此方法用于临床检测报道的空白，对未来实时荧光定量PCR用于临床检测人感染狂犬病病毒的检测及推广有一定的参考价值。
参考文献
[1]Blanton J D，Palmer D，Dyer J，etal.Rabies surveillance in the United States during[J].J Am Vet Med Asso，2011，239：773～783.
[2]王 科，叶 峰，赵英仁.狂犬病的研究进展[J].临床内科杂志，2010，5（27）：298～301.
[3]Bourhy H，Tordo N，Kissi B.Molecular diversity of the Lyssa-virus genns[J]. Virology，1993，194：70～91.
[4]高 鑫，朱武洋，卢学新.实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用[J].中国人兽共患病学报，2018，34（7）：660～666.
[5]罗 明.我国狂犬病流行状况分析及防治对策[J].中国人兽共患病杂志，2005，02.
[6]Zaidman G W，Billingsley A.Corneal impression for the diagnosis of acute rabies encephatilis[J].Ophthalmology，1998，105（2）：249～251.
[7]许远斌，邵明富，范金红，等.基因I型狂犬病毒一步荧光定量PT-PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报，2011，27（4）：297～310.
收稿日期：2018-12-7
关键词：狂犬病病毒;实时荧光定量PCR;检测
中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1004-7344（2019）03-0272-02
狂犬病（rabies）是由狂犬病毒（rabiesvirus，RABV）所致的人兽共患急性传染病，发病后死亡率接近100%。全球每年约有5.5万人死于狂犬病，我国是狂犬病高发地区，因感染狂犬病死亡的人数居世界第二[1]。在我国，狂犬病是国家重点防控的乙类传染病。近年来，由于我国养犬、猫等宠物的家庭日渐增多，该病的发病率呈上升趋势[2]。据中国疾病预防控制中心2017年的最新统计，2017年全国狂犬病发病数为516人，死亡502人。
狂犬病毒属于弹状病毒（Rhabdoviridae）狂犬病毒属，是单股负链RNA病毒，基因组长度为11928～11932nt，编码5种蛋白结构，5种蛋白对应5种结构基因编码，其中N基因具有毒株间的相对保守性和高拷贝复制性，是分子诊断的目标序列[3]。近年来，随着分子生物技术的迅猛发展，核酸诊断技术被应用到狂犬病的诊断中。实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）是基于传统PCR上发展起来的新技术，具有实时监测核算拷贝数量、灵敏度高、检测速度快等优点，被广泛应用于病毒性病原体的快速检测中[4]。目前，国内鲜有采用实时荧光定量PCR技术对人体感染狂犬病病毒样本进行检测的报道。本试验通过实时荧光定量PCR技术对一例人感染狂犬病病毒的病例进行取样检测，旨在为实时荧光定量PCR技术应用到临床检测狂犬病病毒提供参考。
1 材料与方法
1.1 标本信息
患者刘某，男，53岁，重庆市潼南区人。该患者于2018年7月被犬咬伤手臂，暴露程度Ⅲ度，伤口未处理。刘某于2018年11月28日出现烦躁、恐水、怕风、抽出等症状，并于12月1日入院。2018年12月3日晚间19点至4日早上7点期间，时隔2h对患者中段尿及唾液进行采集，共计14个样本（1～7号为尿液样本，8～14号为唾液样本），采集后的样品于-20℃下保存。
1.2 试剂与仪器
病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）和狂犬病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）均购自江苏硕世生物科技有限公司，Real-TimePCRSystem（stepone），全自动核酸提取仪（SSNP-2000A）。
1.3 方 法
1.3.1 核酸提取
将样品于室温条件下融冻，向病毒核酸提取试剂盒对应孔位分别加入样品200μl，置于全自动核酸提取仪中进行核酸提取，具体操作见说明书。提取完成后吸出样品核酸于保存管中，-20℃下保存。
1.3.2 实时荧光定量PCR反应
①反应体系：每人份PT-PCR反应液7.5μl，酶混合液5μl，狂犬病反应液4μl，去RNA酶水3.5μl，样品5μl，总体积25μl。②反应条件：逆转录反应50℃30min，预变性95℃5min，变性95℃10s，退火、延伸及检测荧光55℃40s45个循环。
1.3.3 结果判定方法
（1）阳性对照：Ct≤30且扩增曲线呈典型S型显示。
（2）阴性对照：无典型S型扩增曲线显示。
（3）样本阳性：Ct≤35且曲线呈S型。若样本检测结果35
2 结 果
2.1 实时荧光PCR对尿液样品检测结果
对7个时段采集的病人中段尿样品进行实时荧光定量PCR检测，结果见图1，由图可知2号和6号样本为阴性，其余样本实时荧光定量PCR的Ct值分别为1号：35.68，3号：35.77，4号：36.63，5号：36.12，7号：35.92。
2.2 实时荧光PCR对唾液样品检测结果
对7个时段采集的病人唾液样品进行实时荧光定量PCR检测，结果见图2，由图可知7个唾液样本均含有狂犬病病毒，各样本实时荧光定量PCR的Ct值分别为8号：30.12，9号：31.22，10号：30.91，11號31.75，12号：29.33，13号：29.89：14号29.78。
3 讨 论
本试验采用实时荧光定量PCR方法对以一例真实发病的病人7个时段唾液及尿液为样本进行检测。由结果可知尿液样本中2号和6号样本结果为阴性，其余时段尿液均有病毒检出，而7个唾液样本所有时均为阳性，且曲线的CT值明显优于尿液样本。这是由于狂犬病的最主要传染源是发病和携带病毒的动物，这些动物的唾液中含有大量病毒[5]，并通过咬伤、抓伤进行传染，因此唾液样本的病毒含量远高于尿液样本。而狂犬病毒的分泌量由一定的波动性[6]，因此在尿液样本中出现两个阴性。
目前，对狂犬病毒的实验室诊断方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体技术（FAT）、环介导等温扩增技术（LAMP）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）等。目前FAT技术是WHO和OIE推荐的黄金标准方法，但此方法需要异硫氰酸荧光素盐为荧光标记物标记抗体以定位抗原，同时还需要使用荧光显微镜，操作较繁琐，对试验操作人员专业素质要求较高。实时荧光定量PCR技术以其快速、灵敏、重复性好的特点已被广泛应用于高通量的病毒检测，目前，国内外已经应用这一技术建立了多种检测RABV的荧光定量PCR方法，针对我国狂犬病的流行特征，许运斌[7]等均成功合成引物和探针建立了荧光定量PCR检测RABV的方法。但实时荧光定量PCR技术在试验过程中容易造成样本的污染导致假阳性的出现，这一情况有待进一步研究改善。
狂犬病是一种严重危害人类生命安全的疫病，急需一种快速、准确、灵敏的诊断方法。本试验通过实时荧光定量PCR检测了一例人感染狂犬病病毒的尿液及唾液样本，一定程度上填补了国内使用此方法用于临床检测报道的空白，对未来实时荧光定量PCR用于临床检测人感染狂犬病病毒的检测及推广有一定的参考价值。
参考文献
[1]Blanton J D，Palmer D，Dyer J，etal.Rabies surveillance in the United States during[J].J Am Vet Med Asso，2011，239：773～783.
[2]王 科，叶 峰，赵英仁.狂犬病的研究进展[J].临床内科杂志，2010，5（27）：298～301.
[3]Bourhy H，Tordo N，Kissi B.Molecular diversity of the Lyssa-virus genns[J]. Virology，1993，194：70～91.
[4]高 鑫，朱武洋，卢学新.实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用[J].中国人兽共患病学报，2018，34（7）：660～666.
[5]罗 明.我国狂犬病流行状况分析及防治对策[J].中国人兽共患病杂志，2005，02.
[6]Zaidman G W，Billingsley A.Corneal impression for the diagnosis of acute rabies encephatilis[J].Ophthalmology，1998，105（2）：249～251.
[7]许远斌，邵明富，范金红，等.基因I型狂犬病毒一步荧光定量PT-PCR检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报，2011，27（4）：297～310.
收稿日期：2018-12-7