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摘要：为建立一种新的荧光原位杂交与流式细胞术相结合（FISH-FCM）的方法，以快速鉴定肉食品中的肠杆菌科细菌，采用与肠杆菌科细菌16S rRNA保守序列互补的探针Enter1432并验证其特异性。结果表明：6种肠杆科细菌与探针Enter1432杂交率均在90%以上，而5种非肠杆菌科细菌与探针杂交率均低于1%；与SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》传统培养法相比，FISH-FCM定量检测法全程约需4～5 h，检测8份猪肉样品中肠杆菌科细菌数为1.4万～640万个/g，4份鸡肉样品中肠杆菌科细菌数为5.0万～21万个/g，检出率为100%。综上所述，研究建立的FISH-FCM法可快速检测肉品中的肠杆菌科细菌，适于食品卫生、临床实验室推广使用。
关键词：荧光原位杂交；流式细胞术；肠杆菌科；快速定量检测
中图分类号： TS207.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0336-03
肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌是一类分布极为广泛的革兰氏阴性菌，包括对人致病性较强的埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属细菌[1]。肠杆菌作为欧盟各国食品卫生检查中重要的指标细菌，是国际间食品微生物学实验室质量控制、水平测试的必测项目之一。目前，我国仍以大肠菌群、粪大肠菌群作为食品卫生指标菌。以肠杆科菌替代大肠菌群、粪大肠菌群作为检测指标可消除因后者产气特性随检验方法、试验条件不同而造成结果的不准确性[2]。由于我国农产品生产管理不当，出口畜禽产品中肠杆菌科细菌检测超标现象时有发生，易被欧盟发达国家市场拒绝，进而形成所谓的贸易壁垒。我国进出口商检局经过多次修订，制定了针对畜禽等农产品中肠杆菌检测的行业标准SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》。该标准以传统的细菌培养方法为基础，包括分离培养、生化判定，其步骤繁琐，时间冗长，工作量大，得到报告结果通常需要3 d左右。过长的检验时间使得生产部门延误时间，增加成本，造成一定的经济损失，而且无法应对紧急情况。因此，各级食品卫生防疫部门迫切需要一种快速准确定量检测肠杆菌的方法。本研究通过利用荧光原位杂交与流式细胞术相结合（FISH-FCM）对畜禽肉产品中肠杆菌科细菌进行定量检测，并与传统行标方法进行比较，探讨FISH-FCM在食品安全卫生领域中应用的可行性。
1 材料与方法
1.1 待检样品
本试验检测的8份猪肉样品、4份鸡肉鲜样品分别随机取自江苏省扬州市A、B、C、D等4个不同的农贸市场。
1.2 菌種
本试验中所采用的部分细菌（大肠杆菌、福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）由中国农业科学院家禽研究所唐梦君老师、龚建森老师提供。
1.3 寡核苷酸探针
根据Sghir等报道[3]，试验采用肠杆科细菌特异性探针Enter1432，序列为5′-CTTTTGCAACCCACT-3′。其中5′端由异硫氰酸酯荧光素FITC（Abs/Em=494/520）标记，由宝生物工程（大连）有限公司合成并标记探针。
1.4 FISH-FCM法验证探针的特异性
将大肠杆菌、福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、屎肠球菌11种菌株按照常规划线培养法获得单菌落，在液体培养基中培养，将细菌浓度调整为0.1亿个/mL，杂交方法参照Vaahtovuo等的报道[4-5]并有所改进：（1）取200 μL菌液，用等体积8%多聚甲醛溶液于4 ℃固定1 h；（2）固定完毕后，将样品于12 000 g高速离心10 min，用PBS缓冲液洗涤3次；（3）取 10 μL 固定的菌液，加入85 μL预热的杂交缓冲液（0.9 mol/L NaCl，pH值7.2的20 mmol/L Tris-HCl，0.1% SDS）中，加入5 μL 100 ng/μL 探针，50 ℃杂交2 h；（4）在1 mL PBS缓冲液中加入50 μL杂交溶液，涡旋振荡；（5）将溶液上流式细胞仪（BD FACSCaliburTM，Becton Dickinson，美国），对每个样品分析2 000 个物体。
1.5 FISH-FCM法检测样品
鲜肉样品前处理步骤同SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》，制备成稀释10倍的肉样液。取1 mL肉样液，80 g低速离心1 min，去除杂质。其余杂交方法同上，制备“1.4”节步骤（5）中的液体，加入10 μL 0.5 mg/mL 碘化丙啶，37 ℃避光孵育20 min。加入50 μL 1 000个/μL荧光微球（CountBringhtTM，Invitrogeon，美国）。混合溶液上样于流式细胞仪分析，每个样品分析10 000个物体。
1.6 培养法检测样品
按照SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》中相应方法检测样品。
1.7 试验方法
用CellQuest Pro软件（版本5.2.1，Becton Dickinson，美国）分析。在dot plot 图上，x轴表示杂交结合荧光探针的目的细菌的荧光强度，y轴表示DNA染料的荧光强度。按照以下公式计算肉样品中的细菌数量：
AB×CD×104=测定样本的细菌浓度。
式中：A为目的细菌所占比例，%；B为荧光微球所占比例，%；C为测定样本中的荧光的数量，个；D为测定样本的体积或质量，g/μL。
2 结果与分析
2.1 FISH-FCM法验证探针Enter1432的有效性 由图1-A可知，目标菌株几乎未与探针Enter1432结合，在dot plot散点图上处于Q4区域，呈阴性结果；由图1-B可知，目标菌株大部分与探针Enter1432结合，在dot plot散点图上处于Q3区域，呈阳性结果。由表1可知，6种肠杆科细菌与探针Enter1432的杂交率为91.9%～95.7%，而5种非肠杆科细菌与探针的杂交率均低于1%。
2.2 FISH-FCM法与传统培养法比较检测肉样品中的肠杆科细菌
由图2、表2可知，按照SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》传统培养方法检测8份猪肉样品中肠杆科细菌数量为0.63万～53万CFU/g，4份鸡肉样品中肠杆科细菌数量为0.10万～1.5万CFU/g。用FISH-FCM法检测8份猪肉样品中肠杆科细菌数量为1.4万～640万个/g，4份鸡肉样品中肠杆科细菌数量为5.0万～21万个/g。
3 结论与讨论
荧光原位杂交（FISH）法鉴定微生物最初应用于医学领域[6-8]，荧光素标记的核酸探针可与目的细菌结合，使其在荧光显微镜下显示出相应颜色，该方法具有特异性高、直观的特点，但是由于通常情况下为保证统计结果的准确性，操作人员需要选择多达数10个视野进行分析，这无疑增加了工作量，降低了试验效率。流式细胞术是一种能够对单细胞或其他生物粒子进行理化、免疫及分子生物学等多参数性状检测的现代分析技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点。已有研究将FISH与FCM相结合用于分析活性淤泥、海水样品中目标菌群的数量变化[9-10]。此外，近年来研究人员通过FISH-FCM法分析人体或动物排出粪样中有害菌、有益菌的数量变化，以监测其健康[11-12]。环境中的物质及人或动物的肠道内容物十分复杂，不仅含有大量细菌，还含有许多非细菌物质，包括食物残渣、有机碎屑以及脱落细胞等。虽然目前FISH-FCM尚未被应用于食品安全领域的检测，但是该技术可应用于上述如此复杂成分物质的微生物分析检测，笔者认为对于食品而言，该项技术应该存在较强的可行性，并具有广阔的应用前景。
在本试验中Enter1432探针与6种肠杆科细菌杂交率均在90%以上，而与非肠杆科细菌的杂交率均在1%以内，说明Enter1432探针在鉴定肠杆科细菌上具有较高的特异性，这与前人的研究结果[4，13]一致。在检测猪、鸡鲜肉样品中肠杆菌科细菌数量方面，经SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》法检测发现，12份样品中均检测到肠杆菌科细菌，检出率为100%，且肠杆菌科细菌数量在0.1万～53万CFU/g 之间，不同样品检测结果差异较大。根据瑞士联邦兽医局1981年的标准，生碎肉制品中肠杆科细菌含量的上限是500万CFU/g，而近年欧盟对猪胴体的肠杆科细菌作出了更加严格且上限为3 lg CFU/cm2的规定，由此可见本试验中部分样本肠杆菌科细菌污染较为严重。笔者推测，由于本试验中所采集的鲜肉样本均来自传统集市商贩，肉品在经过屠宰、加工、运输等各个环节中均存在污染的可能。由于欧盟对动物屠宰过程的卫生要求较高，对其加工过程控制进行可追溯且肉品包装后须急冻处理，从而抑制细菌繁殖，后期肉品多经大型超市出售给消费者，而我国目前大多数以摊贩为主要特征的集市贸易手段在上述各个环节中对肉品的卫生控制程度不高，细菌的繁殖滋生现象可能较为明显，因此本试验采集的肉样品存在较高的肠杆菌科细菌检出率、检出数量。
本试验采用FISH-FCM法检测肉样品中的肠杆科细菌数量值是SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》中相应检测法的8.1～20.7倍。由于传统培养方法只针对活的目标细菌，对于已死亡或者弱活力细菌在培养操作过程中无法检测出，而FISH-FCM法针对目标细菌的DNA进行定量，因此无论细菌的生存状态如何，其均能被检测出。其次，由于单个细菌、若干同类细菌在培养过程中均能形成单一菌落，而FISH-FCM针对的是细菌数。基于上述原因，FISH-FCM法检测出的细菌数要比培养法检测出的菌落数高。
综上所述，鉴于传统的培养法耗时长、工作量大的特点，本研究建立的FISH-FCM法可快速检测肉品中的肠杆菌科细菌，适于食品卫生和临床实验室推广使用。
参考文献：
[1]房 海，陈翠珍，张晓君. 肠杆菌科病原细菌[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2011.
[2]Stiles M E，Ng L K. Enterobacteriaceae associated with meats and meat handling[J]. Applied and Environmental Microbiology，1981，41（4）：867-872.
[3]Sghir A，Gramet G，Suau A，et al. Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（5）：2263-2266.
[4]Vaahtovuoa J，Korkeamki M，Munukka E，et al. Microbial balance index—a view on the intestinal microbiota[J]. Pigs
关键词：荧光原位杂交；流式细胞术；肠杆菌科；快速定量检测
中图分类号： TS207.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0336-03
肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌是一类分布极为广泛的革兰氏阴性菌，包括对人致病性较强的埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属细菌[1]。肠杆菌作为欧盟各国食品卫生检查中重要的指标细菌，是国际间食品微生物学实验室质量控制、水平测试的必测项目之一。目前，我国仍以大肠菌群、粪大肠菌群作为食品卫生指标菌。以肠杆科菌替代大肠菌群、粪大肠菌群作为检测指标可消除因后者产气特性随检验方法、试验条件不同而造成结果的不准确性[2]。由于我国农产品生产管理不当，出口畜禽产品中肠杆菌科细菌检测超标现象时有发生，易被欧盟发达国家市场拒绝，进而形成所谓的贸易壁垒。我国进出口商检局经过多次修订，制定了针对畜禽等农产品中肠杆菌检测的行业标准SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》。该标准以传统的细菌培养方法为基础，包括分离培养、生化判定，其步骤繁琐，时间冗长，工作量大，得到报告结果通常需要3 d左右。过长的检验时间使得生产部门延误时间，增加成本，造成一定的经济损失，而且无法应对紧急情况。因此，各级食品卫生防疫部门迫切需要一种快速准确定量检测肠杆菌的方法。本研究通过利用荧光原位杂交与流式细胞术相结合（FISH-FCM）对畜禽肉产品中肠杆菌科细菌进行定量检测，并与传统行标方法进行比较，探讨FISH-FCM在食品安全卫生领域中应用的可行性。
1 材料与方法
1.1 待检样品
本试验检测的8份猪肉样品、4份鸡肉鲜样品分别随机取自江苏省扬州市A、B、C、D等4个不同的农贸市场。
1.2 菌種
本试验中所采用的部分细菌（大肠杆菌、福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）由中国农业科学院家禽研究所唐梦君老师、龚建森老师提供。
1.3 寡核苷酸探针
根据Sghir等报道[3]，试验采用肠杆科细菌特异性探针Enter1432，序列为5′-CTTTTGCAACCCACT-3′。其中5′端由异硫氰酸酯荧光素FITC（Abs/Em=494/520）标记，由宝生物工程（大连）有限公司合成并标记探针。
1.4 FISH-FCM法验证探针的特异性
将大肠杆菌、福氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、屎肠球菌11种菌株按照常规划线培养法获得单菌落，在液体培养基中培养，将细菌浓度调整为0.1亿个/mL，杂交方法参照Vaahtovuo等的报道[4-5]并有所改进：（1）取200 μL菌液，用等体积8%多聚甲醛溶液于4 ℃固定1 h；（2）固定完毕后，将样品于12 000 g高速离心10 min，用PBS缓冲液洗涤3次；（3）取 10 μL 固定的菌液，加入85 μL预热的杂交缓冲液（0.9 mol/L NaCl，pH值7.2的20 mmol/L Tris-HCl，0.1% SDS）中，加入5 μL 100 ng/μL 探针，50 ℃杂交2 h；（4）在1 mL PBS缓冲液中加入50 μL杂交溶液，涡旋振荡；（5）将溶液上流式细胞仪（BD FACSCaliburTM，Becton Dickinson，美国），对每个样品分析2 000 个物体。
1.5 FISH-FCM法检测样品
鲜肉样品前处理步骤同SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》，制备成稀释10倍的肉样液。取1 mL肉样液，80 g低速离心1 min，去除杂质。其余杂交方法同上，制备“1.4”节步骤（5）中的液体，加入10 μL 0.5 mg/mL 碘化丙啶，37 ℃避光孵育20 min。加入50 μL 1 000个/μL荧光微球（CountBringhtTM，Invitrogeon，美国）。混合溶液上样于流式细胞仪分析，每个样品分析10 000个物体。
1.6 培养法检测样品
按照SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》中相应方法检测样品。
1.7 试验方法
用CellQuest Pro软件（版本5.2.1，Becton Dickinson，美国）分析。在dot plot 图上，x轴表示杂交结合荧光探针的目的细菌的荧光强度，y轴表示DNA染料的荧光强度。按照以下公式计算肉样品中的细菌数量：
AB×CD×104=测定样本的细菌浓度。
式中：A为目的细菌所占比例，%；B为荧光微球所占比例，%；C为测定样本中的荧光的数量，个；D为测定样本的体积或质量，g/μL。
2 结果与分析
2.1 FISH-FCM法验证探针Enter1432的有效性 由图1-A可知，目标菌株几乎未与探针Enter1432结合，在dot plot散点图上处于Q4区域，呈阴性结果；由图1-B可知，目标菌株大部分与探针Enter1432结合，在dot plot散点图上处于Q3区域，呈阳性结果。由表1可知，6种肠杆科细菌与探针Enter1432的杂交率为91.9%～95.7%，而5种非肠杆科细菌与探针的杂交率均低于1%。
2.2 FISH-FCM法与传统培养法比较检测肉样品中的肠杆科细菌
由图2、表2可知，按照SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》传统培养方法检测8份猪肉样品中肠杆科细菌数量为0.63万～53万CFU/g，4份鸡肉样品中肠杆科细菌数量为0.10万～1.5万CFU/g。用FISH-FCM法检测8份猪肉样品中肠杆科细菌数量为1.4万～640万个/g，4份鸡肉样品中肠杆科细菌数量为5.0万～21万个/g。
3 结论与讨论
荧光原位杂交（FISH）法鉴定微生物最初应用于医学领域[6-8]，荧光素标记的核酸探针可与目的细菌结合，使其在荧光显微镜下显示出相应颜色，该方法具有特异性高、直观的特点，但是由于通常情况下为保证统计结果的准确性，操作人员需要选择多达数10个视野进行分析，这无疑增加了工作量，降低了试验效率。流式细胞术是一种能够对单细胞或其他生物粒子进行理化、免疫及分子生物学等多参数性状检测的现代分析技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点。已有研究将FISH与FCM相结合用于分析活性淤泥、海水样品中目标菌群的数量变化[9-10]。此外，近年来研究人员通过FISH-FCM法分析人体或动物排出粪样中有害菌、有益菌的数量变化，以监测其健康[11-12]。环境中的物质及人或动物的肠道内容物十分复杂，不仅含有大量细菌，还含有许多非细菌物质，包括食物残渣、有机碎屑以及脱落细胞等。虽然目前FISH-FCM尚未被应用于食品安全领域的检测，但是该技术可应用于上述如此复杂成分物质的微生物分析检测，笔者认为对于食品而言，该项技术应该存在较强的可行性，并具有广阔的应用前景。
在本试验中Enter1432探针与6种肠杆科细菌杂交率均在90%以上，而与非肠杆科细菌的杂交率均在1%以内，说明Enter1432探针在鉴定肠杆科细菌上具有较高的特异性，这与前人的研究结果[4，13]一致。在检测猪、鸡鲜肉样品中肠杆菌科细菌数量方面，经SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》法检测发现，12份样品中均检测到肠杆菌科细菌，检出率为100%，且肠杆菌科细菌数量在0.1万～53万CFU/g 之间，不同样品检测结果差异较大。根据瑞士联邦兽医局1981年的标准，生碎肉制品中肠杆科细菌含量的上限是500万CFU/g，而近年欧盟对猪胴体的肠杆科细菌作出了更加严格且上限为3 lg CFU/cm2的规定，由此可见本试验中部分样本肠杆菌科细菌污染较为严重。笔者推测，由于本试验中所采集的鲜肉样本均来自传统集市商贩，肉品在经过屠宰、加工、运输等各个环节中均存在污染的可能。由于欧盟对动物屠宰过程的卫生要求较高，对其加工过程控制进行可追溯且肉品包装后须急冻处理，从而抑制细菌繁殖，后期肉品多经大型超市出售给消费者，而我国目前大多数以摊贩为主要特征的集市贸易手段在上述各个环节中对肉品的卫生控制程度不高，细菌的繁殖滋生现象可能较为明显，因此本试验采集的肉样品存在较高的肠杆菌科细菌检出率、检出数量。
本试验采用FISH-FCM法检测肉样品中的肠杆科细菌数量值是SN/T 0738—1997《出口食品中肠杆菌科检验方法》中相应检测法的8.1～20.7倍。由于传统培养方法只针对活的目标细菌，对于已死亡或者弱活力细菌在培养操作过程中无法检测出，而FISH-FCM法针对目标细菌的DNA进行定量，因此无论细菌的生存状态如何，其均能被检测出。其次，由于单个细菌、若干同类细菌在培养过程中均能形成单一菌落，而FISH-FCM针对的是细菌数。基于上述原因，FISH-FCM法检测出的细菌数要比培养法检测出的菌落数高。
综上所述，鉴于传统的培养法耗时长、工作量大的特点，本研究建立的FISH-FCM法可快速检测肉品中的肠杆菌科细菌，适于食品卫生和临床实验室推广使用。
参考文献：
[1]房 海，陈翠珍，张晓君. 肠杆菌科病原细菌[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2011.
[2]Stiles M E，Ng L K. Enterobacteriaceae associated with meats and meat handling[J]. Applied and Environmental Microbiology，1981，41（4）：867-872.
[3]Sghir A，Gramet G，Suau A，et al. Quantification of bacterial groups within human fecal flora by oligonucleotide probe hybridization[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（5）：2263-2266.
[4]Vaahtovuoa J，Korkeamki M，Munukka E，et al. Microbial balance index—a view on the intestinal microbiota[J]. Pigs