【摘 要】
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目的构建再生基因4（regenerating gene 4,REG4）的真核表达载体，转染人胚肾细胞293T（human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T），获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV （regenerating islet-derived protein IV, Reg IV）。方法 根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成，将其克隆至pC
【基金项目】
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兰州市科技发展指导性计划项目（2019-ZD-131）：高性能抗RegIV单克隆抗体的制备及鉴定； 甘肃省自然科学基金项目（21JR7RA866）:PG,MUC1,HIK1083联合检测在胃早癌诊断中的临床研究；
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目的构建再生基因4（regenerating gene 4,REG4）的真核表达载体，转染人胚肾细胞293T（human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T），获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV （regenerating islet-derived protein IV, Reg IV）。方法 根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成，将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定，通过转染试剂聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞（实验组），同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组，未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率，分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）与免疫印迹试验（Western-Blot,WB）检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400 （Sephacryl S-400）柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果 经测序和双酶切鉴定，重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组（pEGFP-C1质粒）荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%，表明转染成功。WB结果显示仅在实验组（pCDNA3.4-REG4质粒）的细胞中检测到Reg IV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合，Sephacryl S-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论 成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达，为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。
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