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摘要 利用双抗体夹心酶联免疫吸附法分离得到了PLRV宁夏分离物，并采用RT-PCR技术分离得到了宁夏分离物外壳蛋白基因CP的核苷酸序列，PLRV CP基因共624 bp，推测编码208个氨基酸残基，分子量大小为23 234.2，等电点11.85。通过同源性分析，其与2013年内蒙古分离物（KC456052）最为接近，同源性达99.8%;进化树分析发现其有一定的地理区域性，为单独分支起源。
关键词 马铃薯卷叶病病毒;反转录;宁夏PLRV分离物
中图分类号 S-435.32;S-432.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）11-0096-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.026
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Molecular Biological Identification of Potato Leafroll Virus from Field Samples in Ningxia Province
CHEN Xiao-jun1， GUO Cheng-jin2， WANG Xi-gang2 et al
（1.Agricultural Biotechnology Center， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Lab of Agricultural Biotechnology of Ningxia， Yinchuan， Ningxia 750002;2.Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences /Key Laboratory of Plant Disease and Pest Control， Yinchuan， Ningxia 750002）
Abstract PLRV CP gene was isolated from Ningxia by DAS-ELISA method. The nucleotide sequence of CP gene of PLRV isolated from Ningxia was obtained by RT-PCR. The total length of PLRV CP gene was 624 bp. It was inferred that PLRV CP gene encoded 208 amino acid residues with molecular weight of 23 234.2 and pI of 11.85. Through homology analysis， it was the closest to the isolate （KC456052） from Inner Mongolia in 2013， with 99.8% homology;phylogenetic tree analysis showed that it had a certain geographical region， which was a single branch origin.
Key words PLRV;RT-PCR;Ningxia isolate
马铃薯卷叶病毒（potato leafroll virus，PLRV）是导致马铃薯严重减产的病毒病，通过蚜虫传播，也通过感染病毒的块茎传播，造成30%～80%的产量损失[1]。马铃薯作为宁夏南部山区重要的粮食、蔬菜兼用的经济作物，种植面积达109 927 hm2[2]。马铃薯病毒病时常蔓延，其中PLRV导致马铃薯产量和质量大幅下降。我国已对内蒙古、青海、甘肃、广东、河北等省区的PLRV分离物进行同源性分析，然而宁夏仍缺乏该病毒分离物的序列分析。为此，笔者利用双抗体夹心酶联免疫吸附法分离得到了PLRV宁夏分离物，并采用RT-PCR技术分离得到了宁夏分离物外壳蛋白基因CP的序列，为该病毒病的防治和流行病学奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂。
马铃薯PLRV病毒ELISA试剂盒购于黑龙江省农业科学院，RNA提取试盒为SV Total RNA Isolation System（promega）;RNA反转录试剂盒为mProm-II Reverse Transcriptase（promega）、离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）;T连接载体试剂盒为北京全式金生物技术公司的pEasy-Blunt Simple Coning Kit，Pfu DNA聚合酶与DNA分子量marker为天根生物技术公司产品;引物由北京奥科鼎盛公司合成;其余试剂均为分析纯。
1.1.2 马铃薯病毒样本。
2011年7月，马铃薯PLRV病毒样本在宁夏固原农业推广总站试验田中获得，选择有症状的或从植株的顶部、中部和底部各取1片叶子合在一起，带回实验室于-70 ℃低温保存。
1.2 方法
1.2.1 马铃薯PLRV病毒的确定。
将马铃薯病叶样品（0.10～0.15 g）放于塑料袋中，用记号笔标记好。向样品袋中加入1.0～1.5 mL提取缓冲液（样品重量∶样品提取缓冲液=1∶10），将样品充分研磨。将样品袋中的溶液挤到1.5 mL的離心管中，4 000 r/min离心3 min，取上清液备用。然后按试剂盒说明进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）测定。选定阳性植株备用。 1.2.2 马铃薯总RNA提取。
对阳性材料采用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA，试验步骤按试剂盒操作说明进行，吸取10 μL用于1%琼脂糖电泳，余量RNA保存于-70 ℃超低温冰箱备用。
1.2.3 引物设计。
从Genbank中获得PLRV基因组核苷酸序列（FJ859020.1，FJ853192.1，AY307123.1，X13906.1，GU256062.1，FJ481109.1），利用BLAST和Clustal软件进行保守性分析，设计引物序列：
上游引物PLRV_CPF：5′-ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAATG-3′
下游引物PLRV_CPR：5′-CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCACCCT-3′
引物由北京奥科生物科技有限公司合成。
1.2.4 RT-PCR扩增。
按Promega 公司mProm-Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒说明进行。取2 μg马铃薯总RNA，以Oligo dT为引物，进行总cDNA反转录。反应体系为20 μL，MMLV RT buffer 4 μL，总RNA 2 μL，dNTP 2 μL，反转录酶MMLV 1 μL，Oligo（dT）16 1 μL，RNA酶抑制剂RNasesin 0.5 μL，DEPC处理的H2O 至20 μL。反转录反应为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反转录产物置-20 ℃保存备用。以PLRV_CPF、PLRV_CPR为上下游引物，反转录产物为模板扩增马铃薯PLRV病毒CP蛋白基因。PCR反应体系为25 μL，包含10×buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）1 μL，总cDNA（1 μg/μL）1 μL，ddH2O 25 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循环后，72 ℃最后延伸10 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳上电泳，电压为8 V/cm。
1.2.5 目的条带的回收与T载体克隆。
用DNA回收试剂盒回收扩增产物，连接pEasy-Blunt Simple载体，连接体系：PCR胶回收产物4 μL，载体1 μL;连接15 min后进行转化，在氨苄青霉素的LB平板涂板，过夜培养后挑取10个克隆分别进行摇菌培养，选取3个经PCR检测为阳性的克隆送至英俊生物公司测序。
1.2.6 马铃薯PLRV病毒CP蛋白基因序列分析。
对编码马铃薯PLRV病毒CP蛋白基因序列采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BLAST软件和DNAMAN 7.0进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 马铃薯总RNA的提取
利用RNA提取试剂盒提取马铃薯总RNA电泳结果见图1，样品上样量为10 μL，1、2道均为马铃薯PLRV病毒阳性植株。
2.2 RT-PCR结果
从图2可见，1、2号样品均扩增出627 bp的目标条带，与设计大小一致。
2.3 马铃薯PLRV病毒CP的序列特征
PLRV CP基因共624 bp，推测编码208个氨基酸残基，分子量大小为23 234.2，等电点11.85，没有明显的跨膜蛋白（图3）。PLRV CP蛋白中的17-PRRRRRQSLRRRANR-31 区 域 起 到核定位信号 NLS（nucleolar localization signal）的功能，使CP和通读蛋白（RTP）被翻译后主要存在于细胞核，少量存在于细胞质[3]。
2.4 同源性分析及进化树构建
利用分离得到的宁夏PLRV分离物CP基因序列，结合NCBI中报道国内分离得到的PLRV CP序列，通过DNAMAN 7.0软件分析它们之间的序列同源性，结果见表1。由表1可知，分离得到的宁夏分离物与2013年内蒙古分离物（KC456052）最为接近，同源性达99.8%;与2009 年内蒙古分离物（FJ859027）同源性最远，达98.7%。
PLRV CP进化树由MEGA5软件分析，利用最大似然统计模型构建进化树，结果见图4。由图4可知，国内分离物大致可以分为3类：KC456052、FJ859027、KC456053、FJ859019、FJ859023、FJ859017、FJ853190、DQ309064、FJ859024为第1类;FJ853189、KC456054、EF063711为第2类;FJ859014、FJ859015、FJ859018、FJ859021、FJ853193、FJ853191、FJ859020、FJ853192为第3类，宁夏分离物与这3类分离物关系较远，推测这类分离与国内这些地区的起源不同，属于独立的支系。
3 讨论
在马铃薯脱毒生产中，《马铃薯脱毒种薯》（GB 18133，2000）规定需检测的5种病毒分别为PVS、PLRV、PVX、PVY和PSTVd，是在我国广大马铃薯产区危害严重、发生普遍的5种病毒。
（1）PLRV属于马铃薯黄症病毒组，马铃薯卷叶病毒为直径约26 nm的六边形等轴粒子，主要是由蚜虫以非持久性方式传播。初次侵染的植株，其典型症状是幼叶褪绿、卷曲，一些品种可能产生红晕，尤其是小叶边缘。继发性侵染的植株通常矮化，卷曲的叶片表现为直立、干燥和革质化[1，4]。
（2）目前，对PLRV的检测有目测法、指示植物鉴别法、免疫检测法等，但存在准确度不高、假阳性等问题。建立分子生物学检测法是可靠的病毒鉴定方法，关于该病毒的研究和鉴定已有相关报道[5-11]。高彦萍等[12-13]已经建立并优化了PLRV 反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测体系。陈兆贵等[14]建立了马铃薯卷叶病毒实时荧光定量PCR检测技术。PLRV 也经常在脱毒种苗中检出[15]，原原种中成为危害严重的病害[16]。聂峰杰等[17]对宁夏马铃薯成熟期PLRV进行检测，发现检出率达34%，且广泛种植的6个马铃薯品种均为感病品种。该研究在免疫检测法的基础上，分离了PLRV宁夏分离物，建立了分子生物学方法，同时，分析了PLRV宁夏分离物的进化关系。 （3）南相日等[18]利用植物表达载体构建了马铃薯卷叶病毒CP蛋白基因，并获得了转基因植株，表现出较强的抗卷叶病特性。因此，了解宁夏地区流行的PLRV对于利用基因工程培育抗病马铃薯新品种有一定的理论意义。
参考文献
[1] 张鹤龄.马铃薯卷叶病毒（PLRV）基因组研究进展[J].中国病毒学，1996（1）：1-8.
[2] 宁夏回族自治区统计局，国家统计局宁夏调查总队.宁夏统计年鉴2019[M].北京：中国统计出版社，2019.
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[6] 周云，杨永智.马铃薯卷叶病毒基因组保守序列片段的RT-PCR扩增[J].青海大学学报（自然科学版），2008，26（2）：16-19.
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[10] 哈斯阿古拉，施一燊，张鹤龄.马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因的合成、分子克隆和全序列分析[J].中国病毒学，1992，7（4）：432-435.
[11] 丁铭，方琦，李婷婷，等.马铃薯卷叶病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析[J].植物病理学报，2006，36（5）：473-476.
[12] 高彦萍，吕和平，张武，等.马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].核农学报，2020，34（9）：1943-1950.
[13] 高彦萍，张武，王国祥，等.马铃薯卷叶病毒PLRV RT-LAMP检测方法优化[J].植物保护，2019，45（6）：259-264，306.
[14] 陈兆贵，叶新友，邢澍祺，等.马铃薯卷叶病毒实时荧光定量PCR检测技术研究[J].湖南农业科学，2018（9）：9-12.
[15] 张富荣，戎素平，张艳彦，等.马铃薯主要病毒病对种薯质量的影响[J].种子，2019，38（3）：97-99.
[16] 范国权，白艳菊，高艳玲，等.我国马铃薯主产区病毒病发生情况调查[J].黑龙江农业科学，2014（3）：68-72，87.
[17] 聂峰杰，詹红，张丽，等.RT-PCR技术对宁夏马铃薯脱毒种薯病毒检测的研究[J].植物保护，2016，42（5）：188-193.
[18] 南相日，刘文萍，刘琦，等.马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化及其转基因后代的表达[J].中国农学通报，2007，23（7）：106-109.
关键词 马铃薯卷叶病病毒;反转录;宁夏PLRV分离物
中图分类号 S-435.32;S-432.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）11-0096-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.026
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Molecular Biological Identification of Potato Leafroll Virus from Field Samples in Ningxia Province
CHEN Xiao-jun1， GUO Cheng-jin2， WANG Xi-gang2 et al
（1.Agricultural Biotechnology Center， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Lab of Agricultural Biotechnology of Ningxia， Yinchuan， Ningxia 750002;2.Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences /Key Laboratory of Plant Disease and Pest Control， Yinchuan， Ningxia 750002）
Abstract PLRV CP gene was isolated from Ningxia by DAS-ELISA method. The nucleotide sequence of CP gene of PLRV isolated from Ningxia was obtained by RT-PCR. The total length of PLRV CP gene was 624 bp. It was inferred that PLRV CP gene encoded 208 amino acid residues with molecular weight of 23 234.2 and pI of 11.85. Through homology analysis， it was the closest to the isolate （KC456052） from Inner Mongolia in 2013， with 99.8% homology;phylogenetic tree analysis showed that it had a certain geographical region， which was a single branch origin.
Key words PLRV;RT-PCR;Ningxia isolate
马铃薯卷叶病毒（potato leafroll virus，PLRV）是导致马铃薯严重减产的病毒病，通过蚜虫传播，也通过感染病毒的块茎传播，造成30%～80%的产量损失[1]。马铃薯作为宁夏南部山区重要的粮食、蔬菜兼用的经济作物，种植面积达109 927 hm2[2]。马铃薯病毒病时常蔓延，其中PLRV导致马铃薯产量和质量大幅下降。我国已对内蒙古、青海、甘肃、广东、河北等省区的PLRV分离物进行同源性分析，然而宁夏仍缺乏该病毒分离物的序列分析。为此，笔者利用双抗体夹心酶联免疫吸附法分离得到了PLRV宁夏分离物，并采用RT-PCR技术分离得到了宁夏分离物外壳蛋白基因CP的序列，为该病毒病的防治和流行病学奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂。
马铃薯PLRV病毒ELISA试剂盒购于黑龙江省农业科学院，RNA提取试盒为SV Total RNA Isolation System（promega）;RNA反转录试剂盒为mProm-II Reverse Transcriptase（promega）、离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）;T连接载体试剂盒为北京全式金生物技术公司的pEasy-Blunt Simple Coning Kit，Pfu DNA聚合酶与DNA分子量marker为天根生物技术公司产品;引物由北京奥科鼎盛公司合成;其余试剂均为分析纯。
1.1.2 马铃薯病毒样本。
2011年7月，马铃薯PLRV病毒样本在宁夏固原农业推广总站试验田中获得，选择有症状的或从植株的顶部、中部和底部各取1片叶子合在一起，带回实验室于-70 ℃低温保存。
1.2 方法
1.2.1 马铃薯PLRV病毒的确定。
将马铃薯病叶样品（0.10～0.15 g）放于塑料袋中，用记号笔标记好。向样品袋中加入1.0～1.5 mL提取缓冲液（样品重量∶样品提取缓冲液=1∶10），将样品充分研磨。将样品袋中的溶液挤到1.5 mL的離心管中，4 000 r/min离心3 min，取上清液备用。然后按试剂盒说明进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）测定。选定阳性植株备用。 1.2.2 马铃薯总RNA提取。
对阳性材料采用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA，试验步骤按试剂盒操作说明进行，吸取10 μL用于1%琼脂糖电泳，余量RNA保存于-70 ℃超低温冰箱备用。
1.2.3 引物设计。
从Genbank中获得PLRV基因组核苷酸序列（FJ859020.1，FJ853192.1，AY307123.1，X13906.1，GU256062.1，FJ481109.1），利用BLAST和Clustal软件进行保守性分析，设计引物序列：
上游引物PLRV_CPF：5′-ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAATG-3′
下游引物PLRV_CPR：5′-CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCACCCT-3′
引物由北京奥科生物科技有限公司合成。
1.2.4 RT-PCR扩增。
按Promega 公司mProm-Ⅱ Reverse Transcriptase试剂盒说明进行。取2 μg马铃薯总RNA，以Oligo dT为引物，进行总cDNA反转录。反应体系为20 μL，MMLV RT buffer 4 μL，总RNA 2 μL，dNTP 2 μL，反转录酶MMLV 1 μL，Oligo（dT）16 1 μL，RNA酶抑制剂RNasesin 0.5 μL，DEPC处理的H2O 至20 μL。反转录反应为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反转录产物置-20 ℃保存备用。以PLRV_CPF、PLRV_CPR为上下游引物，反转录产物为模板扩增马铃薯PLRV病毒CP蛋白基因。PCR反应体系为25 μL，包含10×buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）1 μL，总cDNA（1 μg/μL）1 μL，ddH2O 25 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循环后，72 ℃最后延伸10 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳上电泳，电压为8 V/cm。
1.2.5 目的条带的回收与T载体克隆。
用DNA回收试剂盒回收扩增产物，连接pEasy-Blunt Simple载体，连接体系：PCR胶回收产物4 μL，载体1 μL;连接15 min后进行转化，在氨苄青霉素的LB平板涂板，过夜培养后挑取10个克隆分别进行摇菌培养，选取3个经PCR检测为阳性的克隆送至英俊生物公司测序。
1.2.6 马铃薯PLRV病毒CP蛋白基因序列分析。
对编码马铃薯PLRV病毒CP蛋白基因序列采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BLAST软件和DNAMAN 7.0进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 马铃薯总RNA的提取
利用RNA提取试剂盒提取马铃薯总RNA电泳结果见图1，样品上样量为10 μL，1、2道均为马铃薯PLRV病毒阳性植株。
2.2 RT-PCR结果
从图2可见，1、2号样品均扩增出627 bp的目标条带，与设计大小一致。
2.3 马铃薯PLRV病毒CP的序列特征
PLRV CP基因共624 bp，推测编码208个氨基酸残基，分子量大小为23 234.2，等电点11.85，没有明显的跨膜蛋白（图3）。PLRV CP蛋白中的17-PRRRRRQSLRRRANR-31 区 域 起 到核定位信号 NLS（nucleolar localization signal）的功能，使CP和通读蛋白（RTP）被翻译后主要存在于细胞核，少量存在于细胞质[3]。
2.4 同源性分析及进化树构建
利用分离得到的宁夏PLRV分离物CP基因序列，结合NCBI中报道国内分离得到的PLRV CP序列，通过DNAMAN 7.0软件分析它们之间的序列同源性，结果见表1。由表1可知，分离得到的宁夏分离物与2013年内蒙古分离物（KC456052）最为接近，同源性达99.8%;与2009 年内蒙古分离物（FJ859027）同源性最远，达98.7%。
PLRV CP进化树由MEGA5软件分析，利用最大似然统计模型构建进化树，结果见图4。由图4可知，国内分离物大致可以分为3类：KC456052、FJ859027、KC456053、FJ859019、FJ859023、FJ859017、FJ853190、DQ309064、FJ859024为第1类;FJ853189、KC456054、EF063711为第2类;FJ859014、FJ859015、FJ859018、FJ859021、FJ853193、FJ853191、FJ859020、FJ853192为第3类，宁夏分离物与这3类分离物关系较远，推测这类分离与国内这些地区的起源不同，属于独立的支系。
3 讨论
在马铃薯脱毒生产中，《马铃薯脱毒种薯》（GB 18133，2000）规定需检测的5种病毒分别为PVS、PLRV、PVX、PVY和PSTVd，是在我国广大马铃薯产区危害严重、发生普遍的5种病毒。
（1）PLRV属于马铃薯黄症病毒组，马铃薯卷叶病毒为直径约26 nm的六边形等轴粒子，主要是由蚜虫以非持久性方式传播。初次侵染的植株，其典型症状是幼叶褪绿、卷曲，一些品种可能产生红晕，尤其是小叶边缘。继发性侵染的植株通常矮化，卷曲的叶片表现为直立、干燥和革质化[1，4]。
（2）目前，对PLRV的检测有目测法、指示植物鉴别法、免疫检测法等，但存在准确度不高、假阳性等问题。建立分子生物学检测法是可靠的病毒鉴定方法，关于该病毒的研究和鉴定已有相关报道[5-11]。高彦萍等[12-13]已经建立并优化了PLRV 反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测体系。陈兆贵等[14]建立了马铃薯卷叶病毒实时荧光定量PCR检测技术。PLRV 也经常在脱毒种苗中检出[15]，原原种中成为危害严重的病害[16]。聂峰杰等[17]对宁夏马铃薯成熟期PLRV进行检测，发现检出率达34%，且广泛种植的6个马铃薯品种均为感病品种。该研究在免疫检测法的基础上，分离了PLRV宁夏分离物，建立了分子生物学方法，同时，分析了PLRV宁夏分离物的进化关系。 （3）南相日等[18]利用植物表达载体构建了马铃薯卷叶病毒CP蛋白基因，并获得了转基因植株，表现出较强的抗卷叶病特性。因此，了解宁夏地区流行的PLRV对于利用基因工程培育抗病马铃薯新品种有一定的理论意义。
参考文献
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