论文部分内容阅读
摘要：目的 对不同种的蟾皮中蟾蜍噻咛的含量进行研究。方法 采用高效液相色谱法测定不同种蟾皮中蟾蜍噻咛的含量，色谱柱WondsilTMC18（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相乙腈-水（6∶94），检测波长226 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃。结果 回归方程为Y=6 945.3X+82.327，r2=0.999 4，平均回收率为98.57%，蟾皮中蟾蜍噻咛的质量分数在0.041 2～0.824 ?g。结论 蟾蜍噻咛在不同种蟾皮药材中的含量有一定差异。
关键词：中华大蟾蜍；黑框蟾蜍；牛蛙；蟾蜍噻咛；蟾皮；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.017
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0044-02
蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufobufo gargarizans cantor黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥全皮。《本经逢原》中记载蟾皮为蟾蜍去蟾酥、内脏后晒干之物。现代医学研究证明，蟾皮中含有多种化学成分，脂溶性蟾毒配基类成分（如脂蟾毒配基、华蟾酥毒基等）、水溶性成分（蟾蜍噻咛、4-氨基-3-羟甲基-环辛酰胺骈四氢-α-呋喃酮、氨基酸等）及其他金属元素[1-3]。文献记载中华大蟾蜍皮的水制剂在临床上联合化疗有治疗消化道恶性肿瘤作用[4]。其水溶性成分蟾蜍噻咛体外抗肿瘤试验抑制率为87.06%[5]。蟾皮在临床上还可用于治疗小儿厌食等症[6]。笔者采用高效液相色谱法（HPLC），对中华大蟾蜍、黑框蟾蜍、牛蛙的皮中的活性成分蟾蜍噻咛的含量进行比较，为临床合理用药提供可靠数据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（HPLC-DAD）：安捷伦1200；高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS-MS）：Agilent 6410；超声波提取器：
基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项（2009ZX09103- 404）；中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目（Z02063）
通讯作者：边宝林，Tel：（010）64011008；E-mail：bianbaolin9 @yahoo.com.cn
KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；紫外扫描仪：T6新世纪北京普析通用仪器公司；蟾蜍噻咛对照品：含量98%以上，安徽金蟾生化药业有限公司提供。中华大蟾蜍皮样品：安徽金蟾生化药业有限公司提供。黑框蟾蜍皮样品：市售；牛蛙皮样品：北京方庄菜市场；乙腈、甲醇：DikmaPure；高纯水：自制。
试验药材经中国中医科学院中药研究所李军德副研究员鉴定为中华大蟾蜍Bufobufo gargarizans cantor、黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider、牛蛙Rana catesbeiana shaw的干燥皮。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
WondsilTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈-水溶液（6∶94）为流动相；检测波长为226 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃。理论板数按蟾蜍噻咛峰计算应不低于5 000。
2.2 干蟾皮中被测成分的确定
2.2.1 紫外波长检测 蟾蜍噻咛对照品用50%甲醇溶解，使用HPLC-DAD对蟾蜍噻咛对照品200～400 nm扫描，结果显示226 nm处有最大吸收，因此选定226 nm为测定波长。
2.2.2 样品中蟾蜍噻咛成分的确定 经过HPLC-DAD分析，在紫外波长226 nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与蟾蜍噻咛对照品的出峰时间相同。且对照品与样品中蟾蜍噻咛峰的3D光谱相同，因此，初步确定样品中所测定的化学成分即为蟾蜍噻咛。
经过HPLC-MS-MS分析，在紫外波长226 nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与蟾蜍噻咛对照品的出峰时间相同，且其分子量与蟾蜍噻咛对照品相同。再将被测峰进行二级质谱检测，发现样品中被测峰裂解的分子离子碎片与蟾蜍噻咛对照品裂解的分子离子碎片相同，因此，确定样品中所测定的化学成分即为蟾蜍噻咛。
2.3 样品提取条件
2.3.1 样品提取方法 选择加热提取与超声提取两种方法，结果蟾蜍噻咛含量分别为0.068%、0.069%，因此选定使用超声提取的方法提取样品。
2.3.2 样品提取条件正交设计 根据蟾蜍噻咛对照品为水溶性的理化特性，对提取溶媒、提取时间、溶剂倍数等提取条件进行了正交试验设计考察。因素水平见表1。
正交试验结果显示，样品的提取率以为A3B3C1的条件最佳，其中C1与C2的提取率相差不大，为了保证测定的完全、准确。最终选定提取条件为A3B3C2。即以50%甲醇为提取溶媒，提取使用倍数为50倍，超声提取60 min。
2.4 样品溶液制备
精密称取本品细粉约1.0 g，置100 mL量瓶中，加入50%甲醇50 mL，称定，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）60 min，放至室温，补充减失质量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，即得。
2.5 线性关系考察
精密称取蟾蜍噻咛对照品，用50%甲醇配制成浓度为1.648 mg/mL的溶液，摇匀。分别取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置10 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，摇匀。分别取5 μL注入高效液相色谱仪，测定，回归方程为Y=6 945.3X+82.327，r2=0.999 4，线性范围为0.041 2～0.824 ?g。 2.6 精密度试验
精密吸取同一样品，重复测定5次，进行精密度试验。RSD为0.59%。
2.7 样品稳定性试验
按“2.4”项下方法制备供试品溶液，室温下自然放置，分别于2、4、6、20、24 h各测定1次，测至24 h，RSD=0.72%。结果表明，样品溶液中蟾蜍噻咛的含量至少在24 h内稳定性良好。
2.8 重复性试验
分别精密称取6份，按照上述样品的提取处理方法，对样品进行提取处理。试验结果表明RSD=1.56%。可见该方法有良好的重复性。
2.9 加样回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量同一批号的样品6份，分别精密加入对照品溶液（7.60 ?g/mL）50 mL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为98.57%，RSD= 2.03%。结果见表2。
2.10 不同种干蟾皮中蟾蜍噻咛的含量
按样品提取处理方法测定不同种干蟾皮的含量，结果见表3。
3 讨论
中华大蟾蜍、黑框蟾蜍属于蟾蜍科动物，又名癞蛤蟆、癞肚子、癞疙疱。蟾蜍科共13属约335种，分布几乎遍及全球。我国有2属16种，东北、华北、华东、西北都有分布。俄罗斯、朝鲜也有分布。药材来源广泛。牛蛙是蛙科中的一种动物，蛙科是两栖纲中种类最多的一科，全世界有36属500多种，分布于除澳洲和南极洲以外的各大洲。
在临床上入药用的蟾皮主要为中华大蟾蜍、黑框蟾蜍蟾皮，而牛蛙主要食用而不药用。根据上述测定结果，中华大蟾蜍、黑框蟾蜍的蟾皮样品中含有蟾蜍噻咛成分，而牛蛙蛙皮样品中未检测到蟾蜍噻咛，因此，蟾蜍噻咛可作为区分牛蛙蛙皮和中华大蟾蜍、黑框蟾蜍蟾皮的鉴别性成分。且蟾蜍噻咛在两个品种的蟾皮样品中含量有一定差异。
参考文献：
[1] 曹徐涛，王东，王娜，等.蟾皮中蟾毒配基类成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报，2009，26（10）：778-781.
[2] 代丽萍，高慧敏，王智民，等.蟾皮化学成分的分离与结构鉴定[J].药学学报，2007，42（8）：858-861.
[3] 杨立宏，张豁中，张冰.中华大蟾蜍皮化学成分的研究[J].药学学报， 1992，27（9）：679.
[4] 张爱霞，耿桂香.华蟾素联合化疗治疗消化道恶性肿瘤近期疗效观察[J].医学理论与实践，2007，20（6）：678.
[5] 代丽萍，王智民，高慧敏 蟾皮和华蟾素注射液中蟾蜍噻咛含量测定[J].中国中药杂志，2007，32（3）：222-226.
[6] 沈关桢.巧用虫药治儿疾经验撷萃[J].江苏中医药，2004，25（10）：52.
（收稿日期：2012-02-08，编辑：华强）
关键词：中华大蟾蜍；黑框蟾蜍；牛蛙；蟾蜍噻咛；蟾皮；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.017
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0044-02
蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufobufo gargarizans cantor黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥全皮。《本经逢原》中记载蟾皮为蟾蜍去蟾酥、内脏后晒干之物。现代医学研究证明，蟾皮中含有多种化学成分，脂溶性蟾毒配基类成分（如脂蟾毒配基、华蟾酥毒基等）、水溶性成分（蟾蜍噻咛、4-氨基-3-羟甲基-环辛酰胺骈四氢-α-呋喃酮、氨基酸等）及其他金属元素[1-3]。文献记载中华大蟾蜍皮的水制剂在临床上联合化疗有治疗消化道恶性肿瘤作用[4]。其水溶性成分蟾蜍噻咛体外抗肿瘤试验抑制率为87.06%[5]。蟾皮在临床上还可用于治疗小儿厌食等症[6]。笔者采用高效液相色谱法（HPLC），对中华大蟾蜍、黑框蟾蜍、牛蛙的皮中的活性成分蟾蜍噻咛的含量进行比较，为临床合理用药提供可靠数据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（HPLC-DAD）：安捷伦1200；高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS-MS）：Agilent 6410；超声波提取器：
基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项（2009ZX09103- 404）；中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目（Z02063）
通讯作者：边宝林，Tel：（010）64011008；E-mail：bianbaolin9 @yahoo.com.cn
KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；紫外扫描仪：T6新世纪北京普析通用仪器公司；蟾蜍噻咛对照品：含量98%以上，安徽金蟾生化药业有限公司提供。中华大蟾蜍皮样品：安徽金蟾生化药业有限公司提供。黑框蟾蜍皮样品：市售；牛蛙皮样品：北京方庄菜市场；乙腈、甲醇：DikmaPure；高纯水：自制。
试验药材经中国中医科学院中药研究所李军德副研究员鉴定为中华大蟾蜍Bufobufo gargarizans cantor、黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider、牛蛙Rana catesbeiana shaw的干燥皮。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
WondsilTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈-水溶液（6∶94）为流动相；检测波长为226 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃。理论板数按蟾蜍噻咛峰计算应不低于5 000。
2.2 干蟾皮中被测成分的确定
2.2.1 紫外波长检测 蟾蜍噻咛对照品用50%甲醇溶解，使用HPLC-DAD对蟾蜍噻咛对照品200～400 nm扫描，结果显示226 nm处有最大吸收，因此选定226 nm为测定波长。
2.2.2 样品中蟾蜍噻咛成分的确定 经过HPLC-DAD分析，在紫外波长226 nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与蟾蜍噻咛对照品的出峰时间相同。且对照品与样品中蟾蜍噻咛峰的3D光谱相同，因此，初步确定样品中所测定的化学成分即为蟾蜍噻咛。
经过HPLC-MS-MS分析，在紫外波长226 nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与蟾蜍噻咛对照品的出峰时间相同，且其分子量与蟾蜍噻咛对照品相同。再将被测峰进行二级质谱检测，发现样品中被测峰裂解的分子离子碎片与蟾蜍噻咛对照品裂解的分子离子碎片相同，因此，确定样品中所测定的化学成分即为蟾蜍噻咛。
2.3 样品提取条件
2.3.1 样品提取方法 选择加热提取与超声提取两种方法，结果蟾蜍噻咛含量分别为0.068%、0.069%，因此选定使用超声提取的方法提取样品。
2.3.2 样品提取条件正交设计 根据蟾蜍噻咛对照品为水溶性的理化特性，对提取溶媒、提取时间、溶剂倍数等提取条件进行了正交试验设计考察。因素水平见表1。
正交试验结果显示，样品的提取率以为A3B3C1的条件最佳，其中C1与C2的提取率相差不大，为了保证测定的完全、准确。最终选定提取条件为A3B3C2。即以50%甲醇为提取溶媒，提取使用倍数为50倍，超声提取60 min。
2.4 样品溶液制备
精密称取本品细粉约1.0 g，置100 mL量瓶中，加入50%甲醇50 mL，称定，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）60 min，放至室温，补充减失质量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，即得。
2.5 线性关系考察
精密称取蟾蜍噻咛对照品，用50%甲醇配制成浓度为1.648 mg/mL的溶液，摇匀。分别取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置10 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，摇匀。分别取5 μL注入高效液相色谱仪，测定，回归方程为Y=6 945.3X+82.327，r2=0.999 4，线性范围为0.041 2～0.824 ?g。 2.6 精密度试验
精密吸取同一样品，重复测定5次，进行精密度试验。RSD为0.59%。
2.7 样品稳定性试验
按“2.4”项下方法制备供试品溶液，室温下自然放置，分别于2、4、6、20、24 h各测定1次，测至24 h，RSD=0.72%。结果表明，样品溶液中蟾蜍噻咛的含量至少在24 h内稳定性良好。
2.8 重复性试验
分别精密称取6份，按照上述样品的提取处理方法，对样品进行提取处理。试验结果表明RSD=1.56%。可见该方法有良好的重复性。
2.9 加样回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量同一批号的样品6份，分别精密加入对照品溶液（7.60 ?g/mL）50 mL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为98.57%，RSD= 2.03%。结果见表2。
2.10 不同种干蟾皮中蟾蜍噻咛的含量
按样品提取处理方法测定不同种干蟾皮的含量，结果见表3。
3 讨论
中华大蟾蜍、黑框蟾蜍属于蟾蜍科动物，又名癞蛤蟆、癞肚子、癞疙疱。蟾蜍科共13属约335种，分布几乎遍及全球。我国有2属16种，东北、华北、华东、西北都有分布。俄罗斯、朝鲜也有分布。药材来源广泛。牛蛙是蛙科中的一种动物，蛙科是两栖纲中种类最多的一科，全世界有36属500多种，分布于除澳洲和南极洲以外的各大洲。
在临床上入药用的蟾皮主要为中华大蟾蜍、黑框蟾蜍蟾皮，而牛蛙主要食用而不药用。根据上述测定结果，中华大蟾蜍、黑框蟾蜍的蟾皮样品中含有蟾蜍噻咛成分，而牛蛙蛙皮样品中未检测到蟾蜍噻咛，因此，蟾蜍噻咛可作为区分牛蛙蛙皮和中华大蟾蜍、黑框蟾蜍蟾皮的鉴别性成分。且蟾蜍噻咛在两个品种的蟾皮样品中含量有一定差异。
参考文献：
[1] 曹徐涛，王东，王娜，等.蟾皮中蟾毒配基类成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报，2009，26（10）：778-781.
[2] 代丽萍，高慧敏，王智民，等.蟾皮化学成分的分离与结构鉴定[J].药学学报，2007，42（8）：858-861.
[3] 杨立宏，张豁中，张冰.中华大蟾蜍皮化学成分的研究[J].药学学报， 1992，27（9）：679.
[4] 张爱霞，耿桂香.华蟾素联合化疗治疗消化道恶性肿瘤近期疗效观察[J].医学理论与实践，2007，20（6）：678.
[5] 代丽萍，王智民，高慧敏 蟾皮和华蟾素注射液中蟾蜍噻咛含量测定[J].中国中药杂志，2007，32（3）：222-226.
[6] 沈关桢.巧用虫药治儿疾经验撷萃[J].江苏中医药，2004，25（10）：52.
（收稿日期：2012-02-08，编辑：华强）