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摘 要：目的：提取丁酸梭菌肽聚糖并探究其对HT-29细胞凋亡及其相关基因表达水平的影响。方法：本实验首先使用TCA法提取丁酸梭菌肽聚糖，并对其进行红外光谱分析。用不同浓度的肽聚糖溶液处理HT-29细胞24h并使用MTT法检测细胞生长、增殖情况。采用RT-PCR法对蛋白因子Bax、TNF-α、Hsp70、Caspase-3、NF-κB的mRNA表达水平进行检测。结论：肽聚糖对肠道细胞有抑制生长作用；且随浓度增加，抑制作用越强。Bax、TNF-α、Hsp70表达量增加，Caspase-3表达量不变，NF-κB表达量减少。
关键词：丁酸梭菌；肽聚糖；人结肠癌细胞株；凋亡
1 前言
丁酸梭菌是人体内的益生菌，厌氧菌，研究表明对人体并无明显副作用。丁酸梭菌对人体肠道有着重要的保护作用，但是有些作用机制尚不明確，本实验的目的就是研究丁酸梭菌的肽聚糖与肠道细胞的作用机制，为肠道菌群对肠道细胞作用的研究提供新的方向和见解。
2 材料方法
2.1材料
本实验使用人结肠癌HT-29细胞株，培养于含10%胎牛血清1640培养基中，并且进行传代，传代的细胞用于实验。实验使用的是指数期生长的细胞。
2.2实验方法
2.2.1丁酸梭菌肽聚糖的提取和检测
破除细胞壁并去除磷壁酸
1）3000r/min，10min后离心收集菌种，之后加入300mL TCA溶液中，在水浴锅中以100℃沸水浴30min，裂解菌体。
2）待其冷却后，12000r/min，15min后收集细胞壁沉淀，用去离子水洗涤5次。
除蛋白和脂质并检测
1）将沉淀溶于胰蛋白酶-磷酸缓冲液（胰蛋白酶3mg/mL，磷酸缓冲液0.1mol/L，pH8.0）中，37℃培养箱培养12h，再3000r/min，5min，弃沉淀。上清液12000r//min，15min，之后沉淀用去离子水洗涤5次。
2）洗涤后加入甲醇-氯仿溶液（1：1），之后12000rmin，15min，然后70℃干燥箱里干燥，最后得到褐色肽聚糖提取物，进行红外光谱检测。
2.2.2 MTT法检测细胞存活率
1）先使用胰蛋白酶作用于HT-29细胞，再用1640培养液（含有10%胎牛血清、1%双抗）制成细胞悬液，稀释到5x105/mL细胞，加到96孔板中。每孔200μL，放入5% CO2和37℃培养箱中培养。
2）细胞贴壁后析出上清。对照组不加肽聚糖，只加1640培养基，实验组控制肽聚糖浓度分别为200，400，600，800，1000μg/ mL，培养24h。
3）MTT实验前4h，每孔加入10μL 0.5 mg/mL MTT（用0.01 mol/L PBS，pH7.2配制），然后继续在细胞培养箱培养4h。
4）4h后，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡直至结晶溶解。用酶标仪在490 nm测定吸光度值。
5）抑制率的计算，公式为：抑制率（%）=（OD对照-OD实验）/OD对照×100%
2.2.3 RT-PCR检测肽聚糖对HT-29细胞RNA水平的影响
从组织或细胞中提取总RNA，用mRNA作为模板，用引物和逆转录酶形成cDNA。 再使用cDNA作为模板进行PCR扩增以获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR可以分析一些极少量的RNA样品。
3 结果与分析
3.1不同浓度肽聚糖处理对HT-29细胞生长、增殖的影响
肽聚糖浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/ mL，作用于HT-29细胞。根据实验结果，发现24h后，随肽聚糖浓度的增加，吸光度变小，也就是说明肽聚糖浓度越高，细胞存活越少。
之后根据公式：抑制率（%）=（OD对照-OD实验）/OD对照×100%，计算出抑制率，如表3.2，肽聚糖浓度为1000μg/mL时抑制率最高，此时细胞存活最少。
3.2 Bax、TNF-α、Hsp70、Caspase-3和NF-κB的mRNA表达水平
3.2.1不同浓度肽聚糖对HT-29细胞Bax表达的影响
Bax基因是人体最主要的凋亡基因，属于Bcl-2 基因家族。结果显示，如图3.3肽聚糖对Bax的表达有促进作用。肽聚糖能促进其表达，说明能促进凋亡。
3.2.2不同浓度肽聚糖对HT-29细胞TNF-α表达的影响
TNF-α八十年代在欧美曾展开临床研究，然而由于毒副作用严重而被迫终止。但由于TNF-α明确的抗肿瘤活性使得学者们不愿轻易放弃。肽聚糖能促进其表达，说明能促进凋亡。
3.2.3不同浓度肽聚糖对HT-29细胞 Hsp-70表达的影响
Hsp-70是分子量约70kD的热休克蛋白，是热休克蛋白家族中组重要的一员。结果显示肽聚糖对Hsp-70的表达有促进作用，Hsp-70有着促进凋亡的作用，肽聚糖能促进其表达，说明能促进凋亡。
3.2.4不同浓度肽聚糖对HT-29细胞 Caspase-3表达的影响
Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，Caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡，这个过程可以被Bcl-2阻断；在发生凋亡的细胞提取液中去除Caspase-3后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力；再加入纯化的Caspase-3它又能恢复致凋亡的功能。结果显示，肽聚糖对Caspase-3的表达无任何作用。
3.2.5不同浓度肽聚糖对HT-29细胞 NF-κB表达的影响
NF-κB及其介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中的作用是国内外研究的热点。结果显示，肽聚糖对NF-κB的表达有抑制作用，肽聚糖能抑制其表达，说明能促进凋亡。
4 总结与展望
本文实验结果如下：
2）使用MTT法发现肽聚糖对HT-29细胞生长、增殖有抑制作用，并且随着浓度增加，抑制作用越明显；
3）使用RT-PCR法从mRNA表达量分析肽聚糖对HT-29细胞几个细胞因子的影响，发现肽聚糖对BAX和TNF-α和Hsp-70 mRNA的表达量增加，对Caspase-3 mRNA的表达量无明显作用，对NF-κB mRNA的表达量减少。
丁酸梭菌是人体内的益生菌，厌氧菌，研究表明对人体并无明显副作用，而且对肠道菌群的调节有着重要作用，比如调节环境酸碱度杀死有害菌等。本实验的目的就是研究丁酸梭菌的肽聚糖与肠道细胞的作用机制，为肠道菌群对肠道细胞作用的研究提供新的方向和见解。
参考文献：
[1]张同恩. 一定浓度血清通过提高自噬促进人OA软骨细胞存活[D]. 厦门大学，2014.
[2]陈镜羽. 副干酪乳酸杆菌X12肽聚糖的提取及诱导结肠癌细胞免疫原性死亡的作用研究[D]. 哈尔滨工业大学，2014.
[3]White， D. The physiology and biochemistry of prokaryates （3rd ed.）. NY： Oxford University Press Inc.
关键词：丁酸梭菌；肽聚糖；人结肠癌细胞株；凋亡
1 前言
丁酸梭菌是人体内的益生菌，厌氧菌，研究表明对人体并无明显副作用。丁酸梭菌对人体肠道有着重要的保护作用，但是有些作用机制尚不明確，本实验的目的就是研究丁酸梭菌的肽聚糖与肠道细胞的作用机制，为肠道菌群对肠道细胞作用的研究提供新的方向和见解。
2 材料方法
2.1材料
本实验使用人结肠癌HT-29细胞株，培养于含10%胎牛血清1640培养基中，并且进行传代，传代的细胞用于实验。实验使用的是指数期生长的细胞。
2.2实验方法
2.2.1丁酸梭菌肽聚糖的提取和检测
破除细胞壁并去除磷壁酸
1）3000r/min，10min后离心收集菌种，之后加入300mL TCA溶液中，在水浴锅中以100℃沸水浴30min，裂解菌体。
2）待其冷却后，12000r/min，15min后收集细胞壁沉淀，用去离子水洗涤5次。
除蛋白和脂质并检测
1）将沉淀溶于胰蛋白酶-磷酸缓冲液（胰蛋白酶3mg/mL，磷酸缓冲液0.1mol/L，pH8.0）中，37℃培养箱培养12h，再3000r/min，5min，弃沉淀。上清液12000r//min，15min，之后沉淀用去离子水洗涤5次。
2）洗涤后加入甲醇-氯仿溶液（1：1），之后12000rmin，15min，然后70℃干燥箱里干燥，最后得到褐色肽聚糖提取物，进行红外光谱检测。
2.2.2 MTT法检测细胞存活率
1）先使用胰蛋白酶作用于HT-29细胞，再用1640培养液（含有10%胎牛血清、1%双抗）制成细胞悬液，稀释到5x105/mL细胞，加到96孔板中。每孔200μL，放入5% CO2和37℃培养箱中培养。
2）细胞贴壁后析出上清。对照组不加肽聚糖，只加1640培养基，实验组控制肽聚糖浓度分别为200，400，600，800，1000μg/ mL，培养24h。
3）MTT实验前4h，每孔加入10μL 0.5 mg/mL MTT（用0.01 mol/L PBS，pH7.2配制），然后继续在细胞培养箱培养4h。
4）4h后，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡直至结晶溶解。用酶标仪在490 nm测定吸光度值。
5）抑制率的计算，公式为：抑制率（%）=（OD对照-OD实验）/OD对照×100%
2.2.3 RT-PCR检测肽聚糖对HT-29细胞RNA水平的影响
从组织或细胞中提取总RNA，用mRNA作为模板，用引物和逆转录酶形成cDNA。 再使用cDNA作为模板进行PCR扩增以获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR可以分析一些极少量的RNA样品。
3 结果与分析
3.1不同浓度肽聚糖处理对HT-29细胞生长、增殖的影响
肽聚糖浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/ mL，作用于HT-29细胞。根据实验结果，发现24h后，随肽聚糖浓度的增加，吸光度变小，也就是说明肽聚糖浓度越高，细胞存活越少。
之后根据公式：抑制率（%）=（OD对照-OD实验）/OD对照×100%，计算出抑制率，如表3.2，肽聚糖浓度为1000μg/mL时抑制率最高，此时细胞存活最少。
3.2 Bax、TNF-α、Hsp70、Caspase-3和NF-κB的mRNA表达水平
3.2.1不同浓度肽聚糖对HT-29细胞Bax表达的影响
Bax基因是人体最主要的凋亡基因，属于Bcl-2 基因家族。结果显示，如图3.3肽聚糖对Bax的表达有促进作用。肽聚糖能促进其表达，说明能促进凋亡。
3.2.2不同浓度肽聚糖对HT-29细胞TNF-α表达的影响
TNF-α八十年代在欧美曾展开临床研究，然而由于毒副作用严重而被迫终止。但由于TNF-α明确的抗肿瘤活性使得学者们不愿轻易放弃。肽聚糖能促进其表达，说明能促进凋亡。
3.2.3不同浓度肽聚糖对HT-29细胞 Hsp-70表达的影响
Hsp-70是分子量约70kD的热休克蛋白，是热休克蛋白家族中组重要的一员。结果显示肽聚糖对Hsp-70的表达有促进作用，Hsp-70有着促进凋亡的作用，肽聚糖能促进其表达，说明能促进凋亡。
3.2.4不同浓度肽聚糖对HT-29细胞 Caspase-3表达的影响
Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，Caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡，这个过程可以被Bcl-2阻断；在发生凋亡的细胞提取液中去除Caspase-3后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力；再加入纯化的Caspase-3它又能恢复致凋亡的功能。结果显示，肽聚糖对Caspase-3的表达无任何作用。
3.2.5不同浓度肽聚糖对HT-29细胞 NF-κB表达的影响
NF-κB及其介导的细胞信号转导通路在细胞凋亡中的作用是国内外研究的热点。结果显示，肽聚糖对NF-κB的表达有抑制作用，肽聚糖能抑制其表达，说明能促进凋亡。
4 总结与展望
本文实验结果如下：
2）使用MTT法发现肽聚糖对HT-29细胞生长、增殖有抑制作用，并且随着浓度增加，抑制作用越明显；
3）使用RT-PCR法从mRNA表达量分析肽聚糖对HT-29细胞几个细胞因子的影响，发现肽聚糖对BAX和TNF-α和Hsp-70 mRNA的表达量增加，对Caspase-3 mRNA的表达量无明显作用，对NF-κB mRNA的表达量减少。
丁酸梭菌是人体内的益生菌，厌氧菌，研究表明对人体并无明显副作用，而且对肠道菌群的调节有着重要作用，比如调节环境酸碱度杀死有害菌等。本实验的目的就是研究丁酸梭菌的肽聚糖与肠道细胞的作用机制，为肠道菌群对肠道细胞作用的研究提供新的方向和见解。
参考文献：
[1]张同恩. 一定浓度血清通过提高自噬促进人OA软骨细胞存活[D]. 厦门大学，2014.
[2]陈镜羽. 副干酪乳酸杆菌X12肽聚糖的提取及诱导结肠癌细胞免疫原性死亡的作用研究[D]. 哈尔滨工业大学，2014.
[3]White， D. The physiology and biochemistry of prokaryates （3rd ed.）. NY： Oxford University Press Inc.