【摘 要】
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目的 构建肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)基因组全长cDNA感染性克隆,为EV71分子遗传学、致病机制及疫苗研究等建立技术平台.方法 根据EV71 085株病毒全基因组序列,分4个片段对基因组cDNA进行扩增后,将扩增片段定向、顺序克隆至pBluescript SK(+)载体,构建病毒基因组全长cDNA克隆,经体外转录为RNA后,转染Vero细胞获得拯救病毒.经RT-PCR
【机 构】
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100024,北京生物制品研究所病毒性疫苗研究二室,100024,北京生物制品研究所病毒性疫苗研究二室
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目的 构建肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)基因组全长cDNA感染性克隆,为EV71分子遗传学、致病机制及疫苗研究等建立技术平台.方法 根据EV71 085株病毒全基因组序列,分4个片段对基因组cDNA进行扩增后,将扩增片段定向、顺序克隆至pBluescript SK(+)载体,构建病毒基因组全长cDNA克隆,经体外转录为RNA后,转染Vero细胞获得拯救病毒.经RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒.结果 成功构建Ev71基因组全长cDNA克隆,其转染Vero细胞后,可观察到典型的细胞病变;所获得的拯救子代病毒,可被EV71特异性抗血清中和;采用EV71特异性引物进行RT-PCR扩增,可出现长约226 bp的特异性条带;IFA检测可见感染细胞出现黄绿色荧光;透射电镜检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;子代病毒在Vero细胞上连续传8代,滴度维持在4.5～6.0 lgCCID50/ml,略低于母本株(7.5 lgCCID50/ml);噬斑检测发现,空斑形态、大小均一,但比母本株小.结论 成功构建EV71基因组全长cDNA感染性克隆,为深入探讨EV71的致病机制和疫苗研制奠定了基础。
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