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摘 要：檳榔是我国四大南药之首，然而目前关于海南槟榔抗炎活性的研究甚少。本文制备了海南槟榔籽75%乙醇提取物（EA-ANE），并依次得到石油醚部位（PE-ANE）、乙酸乙酯部位（EAC-ANE）、正丁醇部位（BU-ANE）和水相（W-ANE），考察了不同萃取部位对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）产生一氧化氮（NO）、细胞因子和活性氧（ROS）的抑制作用，且测定了不同萃取部位的总多酚、总黄酮和原花青素含量，并采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱技术（UHPLC-QTOF-MS/MS）对抗炎活性较好的萃取部位进行了类黄酮组分的定性鉴定。结果表明，在浓度为0～200 μg/mL，EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO、小鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、前列腺素2（PGE2）和ROS具有抑制作用，且具有浓度依赖性;EAC-ANE中，总多酚、总黄酮和原花青素的含量分别为（517.18±21.81）、（406.40±8.16）、（91.23±5.01）mg/g;从EAC-ANE中鉴定出76种类黄酮化合物，其中，儿茶素的相对含量最高（58.35%），其次为L-表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、原儿茶酸、桔皮素、原儿茶醛等。
关键词：槟榔;抗炎;总多酚;原花青素;类黄酮
中图分类号：S792.91; R284.1 文献标识码：A
Anti-inflammatory Effects and Chemical Constituent Analysis of the Ethanol Extract of Areca catechu Seeds
TANG Minmin1，2， SONG Fei1，2， CHEN Hua1，2， LI Rui3
1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China; 2. Hainan Engineering Research Center of Arecanut Industry， Wenchang， Hainan 571339， China; 3. College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088， China
Abstract： Areca catechu nut is the first of the four southern medicines in China. However， there are few studies on the anti-inflammatory activities of the material produced in Hainan. In this paper， 75% ethanol extract （EA-ANE） from Hainan areca nut seeds was prepared， and four fractions extracted by petroleum ether （PE-ANE）， ethyl acetate （EAC-ANE）， n-butanol （BU-ANE） and water （W-ANE） were obtained in turn. The inhibitory effects of different fractions on the production of nitric oxide （NO）， cell cytokines and reactive oxygen species （ROS） were determined in lipopolysaccharide （LPS） induced macrophages （RAW264.7）. Contents of total phenols， total flavonoids and proanthocyanidins in different fractions of ANE were determined， and 86 flavonoids were identified by ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry （UHPLC-QTOF-MS/MS）. The results showed that EAC-ANE could significantly inhibit the secretion of NO， TNF-α， IL-6， IL-1β， PGE2 and ROS induced by LPS in RAW264.7 cells with a concentration-dependent manner. Contents of total polyphenols， flavonoids and procyanidins EAC-ANE was （517.18±21.81）， （406.40±8.16）， and （91.23±5.01） mg/g， respectively. 76 kinds of flavonoids were identified from the fraction. Among them， the relative content of catechin was the highest （58.35%）， followed by L-epicatechin， procyanidin B1， procyanidin B2， protocatechuic acid， hesperidin， protocatechuic aldehyde. Keywords： Areca catechu nut; anti-inflammatory; total polyphenols; proanthocyanidins; flavonoids
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.030
槟榔为棕榈科植物槟榔（Areca catechu Linn）的果实，是我国四大南药（槟榔、砂仁、益智、巴戟天）之首，在我国中医药中的应用已有将近2000年的历史。传统中医认为，槟榔具有驱虫破积、降气行滞、行水化湿的功效，曾被用于治疗多种寄生虫感染疾病。现代研究表明，槟榔含有生物碱、黄酮类、单宁类、酚酸、原花青素[1-2]以及多糖[3]等多种生理活性物质，具有抗氧化、缓解疲劳[4]、改善肠胃功能[5-6]、抗抑郁[7]、调节血糖水平[8]、抗动脉粥样硬化[9]、抗炎镇痛和抗过敏[10-11]等作用。2020年1月22日，国家卫生健康委员会办公厅发布了《新型冠状病毒诊疗方案（试行第三版）》，槟榔被正式纳入中医诊疗方案的药方。经过辩证讨论与临床实践，《新型冠状病毒诊疗方案》试行第四版至试行第七版的4个版本中继续保留了上述药方，明确了药量，并且新增了针对湿热蕴肺证的包含槟榔的新药方。不仅如此，广东省的新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案中也出现了包含槟榔的药方。因此，槟榔具有重要的药用价值潜力，需要深度挖掘。
项目组前期预实验结果表明，槟榔籽75%乙醇提取物较水提物具有更好的抗炎潜力。因此，本文制备了槟榔籽75%乙醇提取物，并分别分离萃取出石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相部位，筛选出对LPS诱导的RAW264.7 细胞产生一氧化氮（NO）具有较好抑制作用的部位，并研究了活性部位对细胞因子和胞内ROS产生的影响，还测定了不同萃取部位总多酚、总黄酮和原花青素的含量，并对类黄酮成分组成进行了初步定性分析，为科学合理开发槟榔资源，全面评价槟榔的化学成分和药理活性提供基础数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 成熟的槟榔果实采自中国热带农业科学院椰子研究所科研试验基地，去壳取籽，冷冻干燥后粉碎，过60目筛，备用。
小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7），北京北纳创联生物技术研究院;DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗等细胞培养试剂和IL-1β检测试剂盒，赛默飞世尔科技公司;TNF-α和IL-6检测试剂盒，法国DIACLONE公司;PGE2检测试剂盒，艾克索生物科技股份有限公司;噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、Griesss试剂、H2DCF-DA荧光探针、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、没食子酸、芦丁和儿茶素等标准品，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器与设备 SB-800DT 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司;MS-TS分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;HH-1-5L 数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司;Varioskan Flash 全波长多功能酶标仪，美国 Thermo Scientific公司;PHS-3E pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司;RE-5210AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;QP-80S 二氧化碳培养箱，山东博科科学仪器有限公司;752N 紫外分光度光度计，上海担鼎国际贸易有限公司;ExionLC AD超高效液相，美国应用生物系统公司;QTrap 6500高灵敏度质谱，美国应用生物系统公司。
1.2 方法
1.2.1 不同提取部位的制备 槟榔籽75%乙醇提取物的制备参照项目组前期报道[12]。得到乙醇提取物粉末称重后，复溶于蒸馏水，并转移到分液漏斗中，依次分别加入等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并萃取液后，旋转浓缩至干，分别获得槟榔籽75%乙醇提取物（EA-ANE）的石油醚部位（PE-ANE）、乙酸乙酯部位（EAC- ANE）、正丁醇部位（BU-ANE）和水相（W-ANE），称重并计算得率（以槟榔粉干物质计，%）。取以上部位少量溶于二甲基亚砜（DMSO），配制成200 mg/mL的储备液，以0.20 μm微孔滤膜过滤后保存于–20 ℃用于后续实验。
1.2.2 抗炎活性筛选 （1）RAW264.7细胞培养。RAW264.7细胞复苏后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。换液后待细胞生长融合度达到80%～90%即可进行传代。根据不同实验要求，配制不同浓度的细胞悬液接种至96孔板中，或分装到培养皿中继续培养传代。
（2）实验分组及处理。实验分为正常组、LPS组、LPS+地塞米松组（DEX）、LPS+不同浓度的ANE处理组，每组均设6个复孔。正常对照组，不做任何处理，正常培养24 h;LPS组，每孔加入终浓度为1 μg/mL的LPS;LPS+DEX（100 μg/mL）组，每孔先加入终浓度为100 μg/mL的DEX对细胞预处理1 h，再加入终浓度为1 ?g/mL的LPS刺激细胞;LPS+不同浓度的ANE处理组，每孔先加入不同浓度（0～200 μg/mL）的ANE对细胞预处理1 h，再加入终浓度为1 ?g/mL的LPS刺激细胞。
（3）MTT法检测细胞存活率。将RAW264.7细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板，培养过夜后，按照实验分组（不包括LPS组），不加LPS处理细胞。孵育24 h后，取出96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼续孵育2 h后，取出96孔板。吸出上清，每孔加入200 μL DMSO，待反应产物甲臜结晶充分溶解后，用酶标仪于波长495 nm测量吸光度。 存活率=实验组或阴性对照组 OD值/正常组OD值×100%
（4）Griess试剂法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生NO水平。以50 000个/孔的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板，培养过夜后，按照实验分组进行处理。孵育24 h后，取出96孔板。从96孔板各孔中分别取出各组细胞上清液50 μL，转移至新的96孔板并向所有孔中分别加入50 μL浓度为25 g/L的Griess试剂，室温下反应10 min，用酶标仪于570 nm波长测量吸光度。
NO产生率=实验组OD值或正常组OD值/LPS组OD值×100%
（5）ELISA法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生的细胞因子水平。将RAW264.7细胞以120 000个/孔的密度接种于24孔板，培养过夜后，按照实验分组进行处理。孵育24 h后，取出24孔板。培养 24 h，于4 ℃ 3000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，每组均设6个复孔，按照 ELISA 检测试剂盒操作用酶标仪于570 nm波长测量吸光度并计算细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。测定PGE2的含量时，RAW264.7细胞以200 000个/孔的密度接种于96孔板，其余操作同上。
（6）H2DCF-DA荧光探针法测定LPS诱导RAW264.7细胞产生ROS水平。细胞接种和药物浓度按照1.2.2（2）的方法。处理24 h后，用HBSS溶液洗涤细胞，添加20 μmol/L H2DCF-DA，3 ℃避光孵育45 min后，去除H2DCF-DA，用HBSS洗涤细胞。使用酶标仪通过测量二氯荧光素（激发波长480 nm，发射波长530 nm）的荧光测定ROS水平。
细胞内ROS的相对含量=正常组或实验组荧光强度/LPS组荧光强度×100%
1.2.3 总多酚含量测定 不同提取物中总多酚含量采用福林酚氧化法[13]进行测定。波长765 nm处测其吸光度，以甲醇作为空白，根据吸光度与浓度对应关系绘制标准曲线。没食子酸标准曲线为：没食子酸浓度C=83.59×A765–1.2427，R2=0.9997。槟榔籽提取物溶解后，按照同样方法反应后测定吸光度，总多酚含量以每克提取物中的没食子酸当量计。
1.2.4 总黄酮含量测定 不同提取物中总黄酮含量采用亚硝酸钠-硝酸铝法[13]进行测定。反应结束后，在波长510 nm处测其吸光度，根据吸光度与芦丁浓度对应关系绘制标准曲线。芦丁的标准曲线为：芦丁浓度C=201.82×A510–7.8036，R2= 0.9992。槟榔籽提取物溶解后，按照同样方法反应后测定吸光度，总黄酮含量以每克提取物中的芦丁当量计。
1.2.5 原花青素含量测定 不同提取物中原花青素含量采用香草醛-盐酸法[14]进行测定。反应结束后，在波长510 nm处测定吸光度，根据吸光度与儿茶素浓度对应关系绘制标准曲线。儿茶素标准曲线为：儿茶素浓度C=182.83×A510–6.9417，R2=0.9967。槟榔籽提取物溶解后，按照同样方法反应后测定吸光度，原花青素含量以每克提取物中的儿茶素当量计。
1.2.6 类黄酮组分定性测定[15] （1）EAC-ANE类黄酮提取。取10 mg EAC-ANE加入5 mL离心管，加入2000 μL提取液A（75%甲醇含1%乙酸）涡旋30 s后冰水浴超声60 min后，12 000 r/min离心15 min;取1500 μL上清液氮气吹干，加入1500 μL提取液B（50%甲醇含0.1%甲酸）复溶;涡旋30 s后冰水浴超声15 min，12 000 r/min离心15 min;取上清于2 mL进样瓶上机检测。
（2）色谱条件。色谱柱为ACQUITY ULC BEH C18色谱柱（1.7 μm×21 mm×150 mm）;柱温箱温度设为40 ℃，自动进样器温度设为8 ℃，进样体积为2 μL。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%乙腈;总流速为300 μL/min。流动相B梯度洗脱程序为：0～0.5 min，10%;0.5～15 min，60%;15.01～18.00 min，98%;18.01～ 20.00 min，10%。
（3）质谱参数。数据采集时，以多反应监测（MRM）模式进行质谱分析。离子源参数如下：离子喷雾电压为+5000/–4500 V;气帘气压力为35 psi;温度为500 ℃;离子源气体压力1为55 psi;离子源气体压力2为60 psi。
1.3 数据处理
使用SPSS 16.0软件进行统计分析，化学实验重复3次，细胞相关实验至少重复5次，数据结果以平均值±标准偏差表示。组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
2 结果与分析
2.1 槟榔提取物的抗炎作用
2.1.1 不同ANE提取部位对RAW264.7细胞活力的影响 炎症抑制作用筛选实验之前，首先要筛选出对细胞没有毒性作用的活性部位以及安全浓度。在前期预实验基础上，选取了0～200 μg/mL为不同提取物的实验浓度范围。不同质量浓度的ANE萃取部位或100 μg/mL的DEX作用RAW264.7细胞24 h后，检测各细胞存活率，结果见图1。与正常组相比，PE-ANE、EAC-ANE和BU-ANE在实验浓度范围内，对RAW264.7细胞存活率没有显著影响。在50～150 μg/mL时，W-ANE则可以显著提高RAW264.7细胞存活率，这可能是由于水相中含有大量的水溶性营养物质，可以显著促进细胞生长。
2.1.2 EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的抑制作用 NO是免疫调节和炎症介导中的关键因子，可以在多种参与免疫和炎症的细胞中合成。小鼠巨噬细胞经过LPS刺激后，能够表达一氧化氮合酶（NOS），促使细胞生成大量NO，进一步加剧炎症反应[16]。设LPS组细胞产生的NO含量为100%，由图2可知，正常的RAW264.7细胞可以产生一定的NO，经过LPS刺激后，继续产生大量的NO。分别加入不同浓度的槟榔籽提取物萃取部位时，LPS诱导的巨噬细胞内NO含量分别随PE-ANE、EAC-ANE和BU-ANE浓度的增加而逐渐减少，且具有浓度依赖性，其中EAC-ANE的抑制效果最好。当EAC- ANE浓度为200 μg/mL时，细胞内NO相对含量为LPS组的（59.93±1.13）%，而正常组产生的NO相对含量为（43.89±0.96）%。PE-ANE也具有一定的NO抑制能力，这可能是由于该部位具有一定的不饱和脂肪酸[17]和脂溶性活性物质。BU-ANE在测定浓度范围内，也可以显著降低NO的含量。W-ANE在50、100 μg/mL濃度时，可减少细胞分泌NO，但与LPS组相比，并无显著性差异;当浓度继续升高时，NO含量却显著升高，这可能是W-ANE同时含有抑制和促进NO生成的物质， 而当浓度升高时，对NO生成的促进作用更强一些。当DEX处理浓度为100 μg/mL时，LPS诱导的巨噬细胞产生NO的相对含量为（65.08±3.21）%。在浓度为0～200 μg/mL时，EAC- ANE具有更好的抗炎作用且安全，因此，选用该提取部位继续进行实验。
2.1.3 EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生细胞因子的抑制作用 RAW264.7细胞在LPS诱导下，释放大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，而这些促炎因子是引起炎症发生发展的重要诱导剂和增强剂[18]。PGE2也是一种经典的炎性介质分子，广泛分布于人体内的组织与器官，是一种具有生物学活性的重要的前列腺素物质，具有阻止血小板聚集、保护胃粘膜、扩张血管、参与全身的炎症反应等功能。由图3可以看出，EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2具有抑制作用，且具有浓度依赖性。当浓度为50 μg/mL时，EAC-ANE对TNF-α和IL-6的抑制作用不显著，随着浓度增加，抑制作用越来越强，且显著低于LPS组;当EAC-ANE浓度为50 μg/mL时，细胞分泌的IL-1β和PGE2已显著低于LPS对照组。这说明，在实验浓度范围内，EAC-ANE可以抑制以上细胞因子，进而起到抗炎的作用。
2.1.4 EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生ROS的抑制作用 ROS是生物有氧代谢过程中的一种副产品，在细胞信号传导和保持机体稳定性方面起着重要作用。研究表明，当炎症发生时，随着免疫细胞迁移并富集于感染部位，细胞吞噬作用的增强会导致呼吸爆发，经过一系列的反应，ROS大量积累，致使炎症进一步恶化[19]。因此，细胞内ROS水平是评价炎症进程的一个重要指标。由图4可知，正常组细胞会产生一定量的ROS，但是当加入LPS刺激后，细胞的ROS产量显著升高，当添加浓度为50 μg/mL时，EAC-ANE对ROS产生的抑制作用不显著，随着浓度增加，抑制作用越来越强，当添加浓度为100、150、200 μg/mL时，细胞的ROS相对含量均极显著低于LPS组。EAC-ANE可以抑制LPS誘导RAW264.7细胞产生ROS，这可能与EAC-ANE具有良好的抗氧化活性有关。
2.2 槟榔提取物活性物质测定
2.2.1 不同槟榔提取部位的得率及总多酚、总黄酮和原花青素含量 槟榔中含有多种酚类物质，包括缩合单宁、水解单宁、黄酮烷、类黄酮和简单酚酸类物质。槟榔籽烘干后，测定其水分含量为（6.00±0.51）%。采用75%乙醇溶液制备提取物，得率为（23.60±0.15）%（表1）。PE-ANE、EAC-ANE、BU-ANE和W-ANE的得率分别为（18.82±0.14）%、（13.27±0.09）%、（36.06±0.20）%和（31.85±0.18）%，其中BU-ANE的得率最高，这可能是由于正丁醇极性适中，既能部分溶解小极性的物质，也能部分溶解极性稍大的物质。
各提取物中的总多酚含量由大至小顺序为BU-ANE>EAC-ANE>W-ANE>EA-ANE>PE-ANE，其中BU-ANE中总多酚含量最大。各提取物中总黄酮含量大小顺序为EAC-ANE>W-ANE> BU- ANE>EA-ANE>PE-ANE。但这与张丹等[20]报道的70%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的总多酚和总黄酮含量均显著高于正丁醇部位的研究结果有所不同。不同提取物中原花青素含量大小顺序与总黄酮含量一致。另外，由于多酚、黄酮和原花青素3种活性物质的定量均采用化学方法，在反应过程中，一些化学物质的显色效价要高于方法中采用的标准物质，这可能是BU-ANE和EAC-ANE中3种活性物质计算总和超过提取物总质量的原因之一。
2.2.2 EAC-ANE中类黄酮的相对含量 液相色谱串联质谱（LC-MS）技术具有高效灵敏、选择性强且碎片离子重现性好等诸多优点，广泛用于中药和食品化学成分的定性和定量分析[21-23]。本实验结合槟榔中已报道的特征化学物质，筛选了86种类黄酮作为标准品，对EAC-ANE中的类黄酮物质进行靶向定性鉴定。结果表明，从EAC- ANE中共鉴定出了76种类黄酮成分，表2列出了23种相对含量大于0.10%的类黄酮物质，其中儿茶素的含量最高，为58.35%，其次为L-表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、原儿茶酸、红橘素、原儿茶醛等，这些物质均具有良好的体内外抗炎活性[24-28]。
3 讨论
炎症是糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿关节炎等众多疾病的病理过程，安全有效地抑制炎症反应对于治疗各种重大疾病具有积极意义。在一些东南亚国家的民间医学中，槟榔常用于治疗多种炎症，如牙龈炎、结膜炎和水肿等[29]。目前，国内外研究者主要研究了槟榔不同提取物对体内炎症的抑制作用。Khan等[10]制备了槟榔果70%甲醇提取物的三氯甲烷、正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和水相5个萃取部位，发现该槟榔水相部位和二氯甲烷部位均可以不同程度地抑制多种炎症诱导剂（卡拉胶、花生四烯酸、5-羟色胺和PGE2）导致的足肿胀。Huang等[30]提取的台湾槟榔籽原花青素可以抑制角叉菜胶诱导的气囊炎大鼠体内环氧合酶-2（COX-2）蛋白的表达和PGE2的分泌，具有一定的抗炎作用。Bhandare等[31]的研究也证明了这一点。另外，槟榔籽多糖对LPS诱导的小鼠巨噬细胞产生NO具有一定的抑制作用[3]。
本研究结果表明，海南槟榔籽75%乙醇提取物的不同萃取部位都含有多酚、黄酮和原花青素，除了水相（W-ANE）以外，均可以一定程度上抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO，其中以乙酸乙酯萃取部位（EAC-ANE）的作用最好。EAC-ANE中总多酚、总黄酮和原花青素的含量分别为（517.18±21.81）、（406.40±8.16）、（91.23±5.01） mg/g;BU-ANE中也含有大量的多酚类物质，但其中的总黄酮含量和原花青素含量却比EAC-ANE低，这可能是造成二者抗炎作用差异的主要原因，也说明黄酮和原花青素可能是发挥抗炎作用的主要物质。Ho等[32]的研究也报道了这一点，他们发现龙眼花提取物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用是由黄酮类和原花青素类等共同作用的结果，活性优于单一的没食子酸等酚类物质。EAC-ANE可以抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和PGE2，同时可以显著减少炎症模型细胞中活性氧的含量。对于槟榔籽乙酸乙酯萃取部位抗炎作用的机制方面，还需要进一步研究，进而为槟榔药用价值的综合利用提供基础数据。 参考文献
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責任编辑：崔丽虹
关键词：槟榔;抗炎;总多酚;原花青素;类黄酮
中图分类号：S792.91; R284.1 文献标识码：A
Anti-inflammatory Effects and Chemical Constituent Analysis of the Ethanol Extract of Areca catechu Seeds
TANG Minmin1，2， SONG Fei1，2， CHEN Hua1，2， LI Rui3
1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China; 2. Hainan Engineering Research Center of Arecanut Industry， Wenchang， Hainan 571339， China; 3. College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088， China
Abstract： Areca catechu nut is the first of the four southern medicines in China. However， there are few studies on the anti-inflammatory activities of the material produced in Hainan. In this paper， 75% ethanol extract （EA-ANE） from Hainan areca nut seeds was prepared， and four fractions extracted by petroleum ether （PE-ANE）， ethyl acetate （EAC-ANE）， n-butanol （BU-ANE） and water （W-ANE） were obtained in turn. The inhibitory effects of different fractions on the production of nitric oxide （NO）， cell cytokines and reactive oxygen species （ROS） were determined in lipopolysaccharide （LPS） induced macrophages （RAW264.7）. Contents of total phenols， total flavonoids and proanthocyanidins in different fractions of ANE were determined， and 86 flavonoids were identified by ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry （UHPLC-QTOF-MS/MS）. The results showed that EAC-ANE could significantly inhibit the secretion of NO， TNF-α， IL-6， IL-1β， PGE2 and ROS induced by LPS in RAW264.7 cells with a concentration-dependent manner. Contents of total polyphenols， flavonoids and procyanidins EAC-ANE was （517.18±21.81）， （406.40±8.16）， and （91.23±5.01） mg/g， respectively. 76 kinds of flavonoids were identified from the fraction. Among them， the relative content of catechin was the highest （58.35%）， followed by L-epicatechin， procyanidin B1， procyanidin B2， protocatechuic acid， hesperidin， protocatechuic aldehyde. Keywords： Areca catechu nut; anti-inflammatory; total polyphenols; proanthocyanidins; flavonoids
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.030
槟榔为棕榈科植物槟榔（Areca catechu Linn）的果实，是我国四大南药（槟榔、砂仁、益智、巴戟天）之首，在我国中医药中的应用已有将近2000年的历史。传统中医认为，槟榔具有驱虫破积、降气行滞、行水化湿的功效，曾被用于治疗多种寄生虫感染疾病。现代研究表明，槟榔含有生物碱、黄酮类、单宁类、酚酸、原花青素[1-2]以及多糖[3]等多种生理活性物质，具有抗氧化、缓解疲劳[4]、改善肠胃功能[5-6]、抗抑郁[7]、调节血糖水平[8]、抗动脉粥样硬化[9]、抗炎镇痛和抗过敏[10-11]等作用。2020年1月22日，国家卫生健康委员会办公厅发布了《新型冠状病毒诊疗方案（试行第三版）》，槟榔被正式纳入中医诊疗方案的药方。经过辩证讨论与临床实践，《新型冠状病毒诊疗方案》试行第四版至试行第七版的4个版本中继续保留了上述药方，明确了药量，并且新增了针对湿热蕴肺证的包含槟榔的新药方。不仅如此，广东省的新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案中也出现了包含槟榔的药方。因此，槟榔具有重要的药用价值潜力，需要深度挖掘。
项目组前期预实验结果表明，槟榔籽75%乙醇提取物较水提物具有更好的抗炎潜力。因此，本文制备了槟榔籽75%乙醇提取物，并分别分离萃取出石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相部位，筛选出对LPS诱导的RAW264.7 细胞产生一氧化氮（NO）具有较好抑制作用的部位，并研究了活性部位对细胞因子和胞内ROS产生的影响，还测定了不同萃取部位总多酚、总黄酮和原花青素的含量，并对类黄酮成分组成进行了初步定性分析，为科学合理开发槟榔资源，全面评价槟榔的化学成分和药理活性提供基础数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 成熟的槟榔果实采自中国热带农业科学院椰子研究所科研试验基地，去壳取籽，冷冻干燥后粉碎，过60目筛，备用。
小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7），北京北纳创联生物技术研究院;DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗等细胞培养试剂和IL-1β检测试剂盒，赛默飞世尔科技公司;TNF-α和IL-6检测试剂盒，法国DIACLONE公司;PGE2检测试剂盒，艾克索生物科技股份有限公司;噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、地塞米松（dexamethasone，DEX）、Griesss试剂、H2DCF-DA荧光探针、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、没食子酸、芦丁和儿茶素等标准品，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器与设备 SB-800DT 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司;MS-TS分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;HH-1-5L 数显恒温水浴锅，金坛市科析仪器有限公司;Varioskan Flash 全波长多功能酶标仪，美国 Thermo Scientific公司;PHS-3E pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司;RE-5210AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;QP-80S 二氧化碳培养箱，山东博科科学仪器有限公司;752N 紫外分光度光度计，上海担鼎国际贸易有限公司;ExionLC AD超高效液相，美国应用生物系统公司;QTrap 6500高灵敏度质谱，美国应用生物系统公司。
1.2 方法
1.2.1 不同提取部位的制备 槟榔籽75%乙醇提取物的制备参照项目组前期报道[12]。得到乙醇提取物粉末称重后，复溶于蒸馏水，并转移到分液漏斗中，依次分别加入等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并萃取液后，旋转浓缩至干，分别获得槟榔籽75%乙醇提取物（EA-ANE）的石油醚部位（PE-ANE）、乙酸乙酯部位（EAC- ANE）、正丁醇部位（BU-ANE）和水相（W-ANE），称重并计算得率（以槟榔粉干物质计，%）。取以上部位少量溶于二甲基亚砜（DMSO），配制成200 mg/mL的储备液，以0.20 μm微孔滤膜过滤后保存于–20 ℃用于后续实验。
1.2.2 抗炎活性筛选 （1）RAW264.7细胞培养。RAW264.7细胞复苏后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。换液后待细胞生长融合度达到80%～90%即可进行传代。根据不同实验要求，配制不同浓度的细胞悬液接种至96孔板中，或分装到培养皿中继续培养传代。
（2）实验分组及处理。实验分为正常组、LPS组、LPS+地塞米松组（DEX）、LPS+不同浓度的ANE处理组，每组均设6个复孔。正常对照组，不做任何处理，正常培养24 h;LPS组，每孔加入终浓度为1 μg/mL的LPS;LPS+DEX（100 μg/mL）组，每孔先加入终浓度为100 μg/mL的DEX对细胞预处理1 h，再加入终浓度为1 ?g/mL的LPS刺激细胞;LPS+不同浓度的ANE处理组，每孔先加入不同浓度（0～200 μg/mL）的ANE对细胞预处理1 h，再加入终浓度为1 ?g/mL的LPS刺激细胞。
（3）MTT法检测细胞存活率。将RAW264.7细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板，培养过夜后，按照实验分组（不包括LPS组），不加LPS处理细胞。孵育24 h后，取出96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼续孵育2 h后，取出96孔板。吸出上清，每孔加入200 μL DMSO，待反应产物甲臜结晶充分溶解后，用酶标仪于波长495 nm测量吸光度。 存活率=实验组或阴性对照组 OD值/正常组OD值×100%
（4）Griess试剂法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生NO水平。以50 000个/孔的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板，培养过夜后，按照实验分组进行处理。孵育24 h后，取出96孔板。从96孔板各孔中分别取出各组细胞上清液50 μL，转移至新的96孔板并向所有孔中分别加入50 μL浓度为25 g/L的Griess试剂，室温下反应10 min，用酶标仪于570 nm波长测量吸光度。
NO产生率=实验组OD值或正常组OD值/LPS组OD值×100%
（5）ELISA法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生的细胞因子水平。将RAW264.7细胞以120 000个/孔的密度接种于24孔板，培养过夜后，按照实验分组进行处理。孵育24 h后，取出24孔板。培养 24 h，于4 ℃ 3000 r/min离心10 min，收集细胞上清液，每组均设6个复孔，按照 ELISA 检测试剂盒操作用酶标仪于570 nm波长测量吸光度并计算细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。测定PGE2的含量时，RAW264.7细胞以200 000个/孔的密度接种于96孔板，其余操作同上。
（6）H2DCF-DA荧光探针法测定LPS诱导RAW264.7细胞产生ROS水平。细胞接种和药物浓度按照1.2.2（2）的方法。处理24 h后，用HBSS溶液洗涤细胞，添加20 μmol/L H2DCF-DA，3 ℃避光孵育45 min后，去除H2DCF-DA，用HBSS洗涤细胞。使用酶标仪通过测量二氯荧光素（激发波长480 nm，发射波长530 nm）的荧光测定ROS水平。
细胞内ROS的相对含量=正常组或实验组荧光强度/LPS组荧光强度×100%
1.2.3 总多酚含量测定 不同提取物中总多酚含量采用福林酚氧化法[13]进行测定。波长765 nm处测其吸光度，以甲醇作为空白，根据吸光度与浓度对应关系绘制标准曲线。没食子酸标准曲线为：没食子酸浓度C=83.59×A765–1.2427，R2=0.9997。槟榔籽提取物溶解后，按照同样方法反应后测定吸光度，总多酚含量以每克提取物中的没食子酸当量计。
1.2.4 总黄酮含量测定 不同提取物中总黄酮含量采用亚硝酸钠-硝酸铝法[13]进行测定。反应结束后，在波长510 nm处测其吸光度，根据吸光度与芦丁浓度对应关系绘制标准曲线。芦丁的标准曲线为：芦丁浓度C=201.82×A510–7.8036，R2= 0.9992。槟榔籽提取物溶解后，按照同样方法反应后测定吸光度，总黄酮含量以每克提取物中的芦丁当量计。
1.2.5 原花青素含量测定 不同提取物中原花青素含量采用香草醛-盐酸法[14]进行测定。反应结束后，在波长510 nm处测定吸光度，根据吸光度与儿茶素浓度对应关系绘制标准曲线。儿茶素标准曲线为：儿茶素浓度C=182.83×A510–6.9417，R2=0.9967。槟榔籽提取物溶解后，按照同样方法反应后测定吸光度，原花青素含量以每克提取物中的儿茶素当量计。
1.2.6 类黄酮组分定性测定[15] （1）EAC-ANE类黄酮提取。取10 mg EAC-ANE加入5 mL离心管，加入2000 μL提取液A（75%甲醇含1%乙酸）涡旋30 s后冰水浴超声60 min后，12 000 r/min离心15 min;取1500 μL上清液氮气吹干，加入1500 μL提取液B（50%甲醇含0.1%甲酸）复溶;涡旋30 s后冰水浴超声15 min，12 000 r/min离心15 min;取上清于2 mL进样瓶上机检测。
（2）色谱条件。色谱柱为ACQUITY ULC BEH C18色谱柱（1.7 μm×21 mm×150 mm）;柱温箱温度设为40 ℃，自动进样器温度设为8 ℃，进样体积为2 μL。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为100%乙腈;总流速为300 μL/min。流动相B梯度洗脱程序为：0～0.5 min，10%;0.5～15 min，60%;15.01～18.00 min，98%;18.01～ 20.00 min，10%。
（3）质谱参数。数据采集时，以多反应监测（MRM）模式进行质谱分析。离子源参数如下：离子喷雾电压为+5000/–4500 V;气帘气压力为35 psi;温度为500 ℃;离子源气体压力1为55 psi;离子源气体压力2为60 psi。
1.3 数据处理
使用SPSS 16.0软件进行统计分析，化学实验重复3次，细胞相关实验至少重复5次，数据结果以平均值±标准偏差表示。组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
2 结果与分析
2.1 槟榔提取物的抗炎作用
2.1.1 不同ANE提取部位对RAW264.7细胞活力的影响 炎症抑制作用筛选实验之前，首先要筛选出对细胞没有毒性作用的活性部位以及安全浓度。在前期预实验基础上，选取了0～200 μg/mL为不同提取物的实验浓度范围。不同质量浓度的ANE萃取部位或100 μg/mL的DEX作用RAW264.7细胞24 h后，检测各细胞存活率，结果见图1。与正常组相比，PE-ANE、EAC-ANE和BU-ANE在实验浓度范围内，对RAW264.7细胞存活率没有显著影响。在50～150 μg/mL时，W-ANE则可以显著提高RAW264.7细胞存活率，这可能是由于水相中含有大量的水溶性营养物质，可以显著促进细胞生长。
2.1.2 EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的抑制作用 NO是免疫调节和炎症介导中的关键因子，可以在多种参与免疫和炎症的细胞中合成。小鼠巨噬细胞经过LPS刺激后，能够表达一氧化氮合酶（NOS），促使细胞生成大量NO，进一步加剧炎症反应[16]。设LPS组细胞产生的NO含量为100%，由图2可知，正常的RAW264.7细胞可以产生一定的NO，经过LPS刺激后，继续产生大量的NO。分别加入不同浓度的槟榔籽提取物萃取部位时，LPS诱导的巨噬细胞内NO含量分别随PE-ANE、EAC-ANE和BU-ANE浓度的增加而逐渐减少，且具有浓度依赖性，其中EAC-ANE的抑制效果最好。当EAC- ANE浓度为200 μg/mL时，细胞内NO相对含量为LPS组的（59.93±1.13）%，而正常组产生的NO相对含量为（43.89±0.96）%。PE-ANE也具有一定的NO抑制能力，这可能是由于该部位具有一定的不饱和脂肪酸[17]和脂溶性活性物质。BU-ANE在测定浓度范围内，也可以显著降低NO的含量。W-ANE在50、100 μg/mL濃度时，可减少细胞分泌NO，但与LPS组相比，并无显著性差异;当浓度继续升高时，NO含量却显著升高，这可能是W-ANE同时含有抑制和促进NO生成的物质， 而当浓度升高时，对NO生成的促进作用更强一些。当DEX处理浓度为100 μg/mL时，LPS诱导的巨噬细胞产生NO的相对含量为（65.08±3.21）%。在浓度为0～200 μg/mL时，EAC- ANE具有更好的抗炎作用且安全，因此，选用该提取部位继续进行实验。
2.1.3 EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生细胞因子的抑制作用 RAW264.7细胞在LPS诱导下，释放大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，而这些促炎因子是引起炎症发生发展的重要诱导剂和增强剂[18]。PGE2也是一种经典的炎性介质分子，广泛分布于人体内的组织与器官，是一种具有生物学活性的重要的前列腺素物质，具有阻止血小板聚集、保护胃粘膜、扩张血管、参与全身的炎症反应等功能。由图3可以看出，EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2具有抑制作用，且具有浓度依赖性。当浓度为50 μg/mL时，EAC-ANE对TNF-α和IL-6的抑制作用不显著，随着浓度增加，抑制作用越来越强，且显著低于LPS组;当EAC-ANE浓度为50 μg/mL时，细胞分泌的IL-1β和PGE2已显著低于LPS对照组。这说明，在实验浓度范围内，EAC-ANE可以抑制以上细胞因子，进而起到抗炎的作用。
2.1.4 EAC-ANE对LPS诱导RAW264.7细胞产生ROS的抑制作用 ROS是生物有氧代谢过程中的一种副产品，在细胞信号传导和保持机体稳定性方面起着重要作用。研究表明，当炎症发生时，随着免疫细胞迁移并富集于感染部位，细胞吞噬作用的增强会导致呼吸爆发，经过一系列的反应，ROS大量积累，致使炎症进一步恶化[19]。因此，细胞内ROS水平是评价炎症进程的一个重要指标。由图4可知，正常组细胞会产生一定量的ROS，但是当加入LPS刺激后，细胞的ROS产量显著升高，当添加浓度为50 μg/mL时，EAC-ANE对ROS产生的抑制作用不显著，随着浓度增加，抑制作用越来越强，当添加浓度为100、150、200 μg/mL时，细胞的ROS相对含量均极显著低于LPS组。EAC-ANE可以抑制LPS誘导RAW264.7细胞产生ROS，这可能与EAC-ANE具有良好的抗氧化活性有关。
2.2 槟榔提取物活性物质测定
2.2.1 不同槟榔提取部位的得率及总多酚、总黄酮和原花青素含量 槟榔中含有多种酚类物质，包括缩合单宁、水解单宁、黄酮烷、类黄酮和简单酚酸类物质。槟榔籽烘干后，测定其水分含量为（6.00±0.51）%。采用75%乙醇溶液制备提取物，得率为（23.60±0.15）%（表1）。PE-ANE、EAC-ANE、BU-ANE和W-ANE的得率分别为（18.82±0.14）%、（13.27±0.09）%、（36.06±0.20）%和（31.85±0.18）%，其中BU-ANE的得率最高，这可能是由于正丁醇极性适中，既能部分溶解小极性的物质，也能部分溶解极性稍大的物质。
各提取物中的总多酚含量由大至小顺序为BU-ANE>EAC-ANE>W-ANE>EA-ANE>PE-ANE，其中BU-ANE中总多酚含量最大。各提取物中总黄酮含量大小顺序为EAC-ANE>W-ANE> BU- ANE>EA-ANE>PE-ANE。但这与张丹等[20]报道的70%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位的总多酚和总黄酮含量均显著高于正丁醇部位的研究结果有所不同。不同提取物中原花青素含量大小顺序与总黄酮含量一致。另外，由于多酚、黄酮和原花青素3种活性物质的定量均采用化学方法，在反应过程中，一些化学物质的显色效价要高于方法中采用的标准物质，这可能是BU-ANE和EAC-ANE中3种活性物质计算总和超过提取物总质量的原因之一。
2.2.2 EAC-ANE中类黄酮的相对含量 液相色谱串联质谱（LC-MS）技术具有高效灵敏、选择性强且碎片离子重现性好等诸多优点，广泛用于中药和食品化学成分的定性和定量分析[21-23]。本实验结合槟榔中已报道的特征化学物质，筛选了86种类黄酮作为标准品，对EAC-ANE中的类黄酮物质进行靶向定性鉴定。结果表明，从EAC- ANE中共鉴定出了76种类黄酮成分，表2列出了23种相对含量大于0.10%的类黄酮物质，其中儿茶素的含量最高，为58.35%，其次为L-表儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、原儿茶酸、红橘素、原儿茶醛等，这些物质均具有良好的体内外抗炎活性[24-28]。
3 讨论
炎症是糖尿病、肿瘤、动脉粥样硬化、类风湿关节炎等众多疾病的病理过程，安全有效地抑制炎症反应对于治疗各种重大疾病具有积极意义。在一些东南亚国家的民间医学中，槟榔常用于治疗多种炎症，如牙龈炎、结膜炎和水肿等[29]。目前，国内外研究者主要研究了槟榔不同提取物对体内炎症的抑制作用。Khan等[10]制备了槟榔果70%甲醇提取物的三氯甲烷、正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和水相5个萃取部位，发现该槟榔水相部位和二氯甲烷部位均可以不同程度地抑制多种炎症诱导剂（卡拉胶、花生四烯酸、5-羟色胺和PGE2）导致的足肿胀。Huang等[30]提取的台湾槟榔籽原花青素可以抑制角叉菜胶诱导的气囊炎大鼠体内环氧合酶-2（COX-2）蛋白的表达和PGE2的分泌，具有一定的抗炎作用。Bhandare等[31]的研究也证明了这一点。另外，槟榔籽多糖对LPS诱导的小鼠巨噬细胞产生NO具有一定的抑制作用[3]。
本研究结果表明，海南槟榔籽75%乙醇提取物的不同萃取部位都含有多酚、黄酮和原花青素，除了水相（W-ANE）以外，均可以一定程度上抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生NO，其中以乙酸乙酯萃取部位（EAC-ANE）的作用最好。EAC-ANE中总多酚、总黄酮和原花青素的含量分别为（517.18±21.81）、（406.40±8.16）、（91.23±5.01） mg/g;BU-ANE中也含有大量的多酚类物质，但其中的总黄酮含量和原花青素含量却比EAC-ANE低，这可能是造成二者抗炎作用差异的主要原因，也说明黄酮和原花青素可能是发挥抗炎作用的主要物质。Ho等[32]的研究也报道了这一点，他们发现龙眼花提取物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用是由黄酮类和原花青素类等共同作用的结果，活性优于单一的没食子酸等酚类物质。EAC-ANE可以抑制LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）和PGE2，同时可以显著减少炎症模型细胞中活性氧的含量。对于槟榔籽乙酸乙酯萃取部位抗炎作用的机制方面，还需要进一步研究，进而为槟榔药用价值的综合利用提供基础数据。 参考文献
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責任编辑：崔丽虹