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摘 要：为确定5种不同颜色叶片的红枫的遗传范围，以红枫叶片DNA为模板，通过SRAP-PCR扩增体系优化，对88个引物组合筛选后进行19对引物的SRAP标记。研究结果表明，5种红枫DNA可被15对引物区分，扩增出特异性条带，其基因组有差异。
关键词：红枫；叶片；SRAP；分子标记
中图分类号 S792.99 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）12-13-04
红枫为槭树科槭树属鸡爪槭的园艺变种，以其优美的树姿、别致的叶形、丰富的季相而著称，是南方园林中广泛应用的红色叶树种。在生产实践中，笔者发现了紫色、深红色、鲜红色、黄色和叶片红叶脉黄5种不同颜色的红枫。
序列扩增相关多态性是由Li和Quiros在2001年提出的一种新型分子标记[1]，该标记利用1对引物对基因组DNA进行扩增，又叫一步PCR法。它具有操作简便、高度共显性、遍布整个基因组、便于克隆测序目标片断等特点。本研究用SRAP对红枫5种不同颜色叶片的DNA进行标记，标记其基因组差异性。
1 材料与方法
1.1 材料 试验于2012年5～7月进行，供试材料分别为红枫S16紫色叶片、S27深红色叶片、S39鲜红色叶片、S24黄色叶片和S3花叶（叶片红色，叶脉黄色）5种。取当年生嫩叶，用保温桶带回实验室，提取DNA，-20℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取与分离 按改良的CTAB的方法[2]提取基因组DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量。稀释至所需浓度后，-20℃保存。
1.2.2 SRAP标记 引物选择参考Lin等[3]、Ferriol[4]等和Riaz[5]等的方法。所选引物序列如表1所示。
正向引物和反向引物由上海生工公司合成。根据合成引物的Tm值，确立合适的退火温度。建立特异引物PCR扩增的反应体系，进行PCR扩增，前5个循环为94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1.5min，后30个循环仅将复性温度升为50℃。最后72℃延伸8min。最后，筛选出12对特异性引物对5种红枫DNA进行标记。
2 结果与分析
2.2 扩增条件优化结果 参照何正文等[6]和汪结明等[7]的正交设计直观分析方法，按表3设计的16个处理进行PCR反应，进行正交试验后，将所得到的产物进行电泳，结果如图2。
从图2中可以看出，第5种体系条带较清晰，最终的正交优化结果如下：
在25μL反应体系的PCR薄壁管中依次加入：
ddH2O，17.85μL；10×PCRbuffer，1.6μL；正向引物（10μmol/L），0.45μL；反向引物（10μmol/L），0.45μL；MgCl2（2.5mmol/L），1.6μL；dNTPs（0.2mmol/L），0.75μL；Taq聚合酶（5U/μL），0.3μL；模板DNA（50ng），2μL。
2.3 引物筛选 采取上述优化体系，以编号为S3的DNA作为模板，共筛选了88对引物组合。
由图3、4、5可以看出，在相同的扩增条件下，不同引物扩增结果明显不同，呈现多态性，在条带的位置和条带的亮度、宽度、多少等方面都存在一定的差异。
扩增结果如图3、4、5，筛选出清晰、明亮、多态性好的引物组合为me1me8，me1em10，me1em11，me2em4，me2em9，me3em6，me4em10，me5em1，me5em5，me5em10，me7em2，me7em4，me7em5，me7em6，me7em7，me7em9，me8em3，me8em5，me8em8。
2.4 SRAP标记 挑选上述19对引物对红枫5种DNA分别进行扩增，DNA中出现差异性条带，如图6所示。
从图6中可以看出，19对引物中，共扩增出了59条带，特异性条带为24条。引物me2em4，me2em9，me4em10，me7em2，me7em7，me8em5无特异性条带，其余15对引物均能区分5种DNA，结果如表4所示。
3 结论与讨论
3.1 结论 本实验中，筛选的19对引物对红枫DNA标记结果表明，me1me8，me1em10，me1em11，me3em6，me5em1，me5em5，me5em10，me7em2，me7em4，me7em5，me7em6，me7em9，me8em3，me8em5，me8em8共15对引物能区分5种DNA，说明这5种红枫叶片颜色的不同是基因组上的差异。
3.2 讨论
3.2.1 关于SRAP引物的筛选 筛选多个引物构建指纹图谱可以使生物型之间条带组合差异足够大，可确保鉴别结果更准确可靠。这样构建的指纹图谱即使需要鉴定的生物型不在图谱范围内，也不容易错判。
筛选的引物需要符合2个要求：（1）引物多态性好。多态性好的引物扩增结果可得到大量条带，信息量丰富。这样能较好地看出亲本之间差异性，有利于遗传研究。（2）引物扩增的条带间距大。条带间距大，各条带分子量容易确定，可确保生物型鉴定不容易出错。
3.2.2 关于SRAP-PCR分子标记 SRAP反应涉及的因素多，每一个因素都有可能影响整个SRAP的稳定性和重复性，本研究中对SRAP反应进行了优化筛选，并在标记中做了重复，结果基本稳定一致，说明SRAP标记的稳定性较好。
本研究的实验操作中出现了一些问题，试验中得出的解决途径如下：（1）不同的研究材料、试验仪器和药品需要摸索其合适的最佳反应条件；（2）试验操作一定要规范，严格保持反应条件、反应程序、试验仪器和药品的一致性；（3）加样要准确，SRAP反应中由于各组分的用量很少，即使精密的微量移液管，也很难保证其加样准确一致。在试验中可以采用混合加样，将除模板DNA以外的各组分先混合，充分混匀后分别加入薄壁管中，后再加入模板DNA，这样可以最大限度地保证反应管中各组分浓度的一致性；（4）电泳缓冲液要经常更换，一般电泳时泡沫明显增多时应及时更换缓冲液，否则条带容易产生拖尾现象。 总之，只要认真优化反应体系，试验操作规范，尽可能保持试验条件和各反应因子的一致性，就能得到良好的扩增效果。
参考文献
[1]Li G，Quiros C F.Sequence-related amplifid polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassia[J].Theor Ape Genel，2001，103：455-461.
[2]王关林，方宏筠.植物基因工程[M].第二版.北京：科学出版社，2002：533-535.
[3]Lin ZX，Zhang XL，Nie YC.Evaluation of application of a new molecular marker SRAP on analysis of F2 segregation opulation and genetic diversity in cotton [J].Acta Genet Sinica，2004，31（6）：622-626.
[4]Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theor Appl Genet，2003，107：271-282.
[5]Riaz A，Potter D，Stephen M.Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers[J].J Amer Soc Hort Sci，2004，129：204-211.
[6]何正文，刘运生，陈立华，等.正交设计直观分析法优化条件PCR[J]. 湖南医科大学学报，1998，23（4）：403-404.
[7]汪结明，项艳，吴大强，等.杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化[J]. 核农学报，2007，21（5）：470-473.
（责编：徐世红）
关键词：红枫；叶片；SRAP；分子标记
中图分类号 S792.99 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）12-13-04
红枫为槭树科槭树属鸡爪槭的园艺变种，以其优美的树姿、别致的叶形、丰富的季相而著称，是南方园林中广泛应用的红色叶树种。在生产实践中，笔者发现了紫色、深红色、鲜红色、黄色和叶片红叶脉黄5种不同颜色的红枫。
序列扩增相关多态性是由Li和Quiros在2001年提出的一种新型分子标记[1]，该标记利用1对引物对基因组DNA进行扩增，又叫一步PCR法。它具有操作简便、高度共显性、遍布整个基因组、便于克隆测序目标片断等特点。本研究用SRAP对红枫5种不同颜色叶片的DNA进行标记，标记其基因组差异性。
1 材料与方法
1.1 材料 试验于2012年5～7月进行，供试材料分别为红枫S16紫色叶片、S27深红色叶片、S39鲜红色叶片、S24黄色叶片和S3花叶（叶片红色，叶脉黄色）5种。取当年生嫩叶，用保温桶带回实验室，提取DNA，-20℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取与分离 按改良的CTAB的方法[2]提取基因组DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量。稀释至所需浓度后，-20℃保存。
1.2.2 SRAP标记 引物选择参考Lin等[3]、Ferriol[4]等和Riaz[5]等的方法。所选引物序列如表1所示。
正向引物和反向引物由上海生工公司合成。根据合成引物的Tm值，确立合适的退火温度。建立特异引物PCR扩增的反应体系，进行PCR扩增，前5个循环为94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1.5min，后30个循环仅将复性温度升为50℃。最后72℃延伸8min。最后，筛选出12对特异性引物对5种红枫DNA进行标记。
2 结果与分析
2.2 扩增条件优化结果 参照何正文等[6]和汪结明等[7]的正交设计直观分析方法，按表3设计的16个处理进行PCR反应，进行正交试验后，将所得到的产物进行电泳，结果如图2。
从图2中可以看出，第5种体系条带较清晰，最终的正交优化结果如下：
在25μL反应体系的PCR薄壁管中依次加入：
ddH2O，17.85μL；10×PCRbuffer，1.6μL；正向引物（10μmol/L），0.45μL；反向引物（10μmol/L），0.45μL；MgCl2（2.5mmol/L），1.6μL；dNTPs（0.2mmol/L），0.75μL；Taq聚合酶（5U/μL），0.3μL；模板DNA（50ng），2μL。
2.3 引物筛选 采取上述优化体系，以编号为S3的DNA作为模板，共筛选了88对引物组合。
由图3、4、5可以看出，在相同的扩增条件下，不同引物扩增结果明显不同，呈现多态性，在条带的位置和条带的亮度、宽度、多少等方面都存在一定的差异。
扩增结果如图3、4、5，筛选出清晰、明亮、多态性好的引物组合为me1me8，me1em10，me1em11，me2em4，me2em9，me3em6，me4em10，me5em1，me5em5，me5em10，me7em2，me7em4，me7em5，me7em6，me7em7，me7em9，me8em3，me8em5，me8em8。
2.4 SRAP标记 挑选上述19对引物对红枫5种DNA分别进行扩增，DNA中出现差异性条带，如图6所示。
从图6中可以看出，19对引物中，共扩增出了59条带，特异性条带为24条。引物me2em4，me2em9，me4em10，me7em2，me7em7，me8em5无特异性条带，其余15对引物均能区分5种DNA，结果如表4所示。
3 结论与讨论
3.1 结论 本实验中，筛选的19对引物对红枫DNA标记结果表明，me1me8，me1em10，me1em11，me3em6，me5em1，me5em5，me5em10，me7em2，me7em4，me7em5，me7em6，me7em9，me8em3，me8em5，me8em8共15对引物能区分5种DNA，说明这5种红枫叶片颜色的不同是基因组上的差异。
3.2 讨论
3.2.1 关于SRAP引物的筛选 筛选多个引物构建指纹图谱可以使生物型之间条带组合差异足够大，可确保鉴别结果更准确可靠。这样构建的指纹图谱即使需要鉴定的生物型不在图谱范围内，也不容易错判。
筛选的引物需要符合2个要求：（1）引物多态性好。多态性好的引物扩增结果可得到大量条带，信息量丰富。这样能较好地看出亲本之间差异性，有利于遗传研究。（2）引物扩增的条带间距大。条带间距大，各条带分子量容易确定，可确保生物型鉴定不容易出错。
3.2.2 关于SRAP-PCR分子标记 SRAP反应涉及的因素多，每一个因素都有可能影响整个SRAP的稳定性和重复性，本研究中对SRAP反应进行了优化筛选，并在标记中做了重复，结果基本稳定一致，说明SRAP标记的稳定性较好。
本研究的实验操作中出现了一些问题，试验中得出的解决途径如下：（1）不同的研究材料、试验仪器和药品需要摸索其合适的最佳反应条件；（2）试验操作一定要规范，严格保持反应条件、反应程序、试验仪器和药品的一致性；（3）加样要准确，SRAP反应中由于各组分的用量很少，即使精密的微量移液管，也很难保证其加样准确一致。在试验中可以采用混合加样，将除模板DNA以外的各组分先混合，充分混匀后分别加入薄壁管中，后再加入模板DNA，这样可以最大限度地保证反应管中各组分浓度的一致性；（4）电泳缓冲液要经常更换，一般电泳时泡沫明显增多时应及时更换缓冲液，否则条带容易产生拖尾现象。 总之，只要认真优化反应体系，试验操作规范，尽可能保持试验条件和各反应因子的一致性，就能得到良好的扩增效果。
参考文献
[1]Li G，Quiros C F.Sequence-related amplifid polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassia[J].Theor Ape Genel，2001，103：455-461.
[2]王关林，方宏筠.植物基因工程[M].第二版.北京：科学出版社，2002：533-535.
[3]Lin ZX，Zhang XL，Nie YC.Evaluation of application of a new molecular marker SRAP on analysis of F2 segregation opulation and genetic diversity in cotton [J].Acta Genet Sinica，2004，31（6）：622-626.
[4]Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers[J]. Theor Appl Genet，2003，107：271-282.
[5]Riaz A，Potter D，Stephen M.Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers[J].J Amer Soc Hort Sci，2004，129：204-211.
[6]何正文，刘运生，陈立华，等.正交设计直观分析法优化条件PCR[J]. 湖南医科大学学报，1998，23（4）：403-404.
[7]汪结明，项艳，吴大强，等.杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化[J]. 核农学报，2007，21（5）：470-473.
（责编：徐世红）