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【摘 要】目的：探讨与胶质母细胞瘤瘤周水肿相关的基因表达，寻找肿瘤基因治疗的靶点。方法：收集胶质母细胞瘤的肿瘤标本和磁共振图像，运用基因芯片技术分析与瘤周水肿相关的差异表达基因。结果：瘤周水肿相关的差异基因主要为VEGF、NPTX2等。结论：胶质母细胞瘤瘤周水肿与VEGF密切相关，是多基因共同作用的结果。
【關键词】胶质母细胞瘤；瘤周水肿；基因芯片
【中图分类号】R739.41 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0142—02
胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性胶质瘤，传统的综合治疗后2年生存率仍不足10%[1]。瘤周水肿是胶质母细胞瘤最常见的磁共振图像特征。但是即使是同一病理级别的胶质母细胞瘤，其瘤周水肿程度也不尽相同，提示瘤周水肿可能有着内在的基因表达在起作用[2]。近几年基因芯片技术得到飞速发展，可同时检测数千钟至数万种基因的表达情况。高通量的特性，使得基因芯片技术在肿瘤的分子机制、分子分型、分子诊断、药理和毒理基因组学的研究中得到了广泛的应用。本文使用illumina表达谱芯片对30例胶质母细胞瘤样本进行了分析，筛选出差异表达基因，并结合磁共振图像，运用Spearman等级相关分析与瘤周水肿相关的差异基因。
1 材料与方法
1.1 病人资料
所有30例经病理证实为星形细胞瘤Ⅳ级的肿瘤标本，均取自于徐州医学院附属医院神经外科2009年5月-2012年12月手术中切除的肿瘤组织。胶质母细胞瘤患者中男性19例，女性11例，年龄32-74岁，平均52.1岁。患者术前均常规行磁共振T1、T2、T1增强和Flair像，根据瘤周水肿的大小分为无明显水肿、中度水肿（水肿范围在0-2 cm）、高度水肿（水肿范围>2 cm）三个级别，每个级别各10例。
1.2 基因芯片检测
通过Unizol法抽提30例胶质母细胞瘤总RNA，经质量鉴定合格后，反转录合成cDNA，对cDNA进行纯化后反转录合成cRNA，再对cRNA进行纯化，然后与illumina全基因组表达8-样本杂交，用BeadStation对杂交芯片进行扫描，利用cy3 （532nm）的荧光信号强度之间的关系计算出不同样本之间的差异性。
1.3 差异基因筛选标准
对差异基因的筛选标准是计算其diffsocre值，diffsocre≥40认为是上调基因，diffsocre≤-40认为是下调基因。
1.4 统计学分析
Spearman等级相关
2 结果
芯片扫描后，经过数据分析，瘤周水肿相关的差异基因主要为VEGF、AQP-3、AQP-4、NO、PDGF、NOS、MMP-9、NPTX2、HIF-1α、IGFBP-5、RBBP-8、PI3K、TXB2、HGF、IGF2R、PTEN、BAI3、TIMP1。
3 讨论
本实验发现，与瘤周水肿相关的差异中，大部分是促血管生成和抗血管生成基因。病理观察[3]发现新生的肿瘤细胞结构不完整，管壁薄弱，缺乏平滑肌，基底膜稀疏，易被肿瘤细胞穿透，这些特点影响血脑屏障的完整性，血浆和一些大分子物质可通过破损的血脑屏障渗透到细胞间隙，加之引流静脉被受压和侵蚀，回收水肿液功能降低，使其在瘤体周围聚集，形成瘤周水肿。
胶质母细胞瘤瘤周中、高度水肿与无明显水肿相比，VEGF的表达存在显著差异，VEGF与胶质母细胞瘤瘤周水肿存在正相关性。血管内皮生长因子（VEGF）是由胶质母细胞在体内分泌的较大量的特异性诱导血管渗透性、内皮细胞生长和血管生成的生长因子[4]，VEGF引起胶质母细胞瘤瘤周水肿的机理目前尚未完全明了。Richard[5]等证实在体内外人类多形性胶质母细胞瘤能产生VEGF，且由多形性胶质母细胞瘤细胞所诱导的渗透性多数由VEGF引起。Machein[6]等研究发现，糖皮质激素可抑制VEGF表达从而减轻胶质瘤瘤周水肿。进一步揭示出VEGF在胶质瘤瘤周水肿中的作用。Pope WB[7]等运用VEGF特异性抑制剂阿瓦斯丁来抑制肿瘤中VEGF的表达，能够见到瘤周水肿明显的减轻，也揭示了VEGF在瘤周水肿的形成中起到很重要的作用。但是不是所有的病人都对阿瓦斯丁敏感，水肿无明显的减轻，说明瘤周水肿的形成不是只有一条基因在起作用，很可能是多基因表达共同作用的结果。
神经元正五聚蛋白（Neuronal pentraxin，NP，NPTX），该蛋白有两个亚型，NPTX1和NPTX2[8]。NPTX1蛋白分布比较局限，仅神经元细胞可以分泌，要介导对降解的突触物质的摄取。与NPTX1不同，NPTX2的分布较广，在脑、肝脏、胰腺、心脏、骨骼肌和睾丸中均有表达。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是近几年来逐渐被发现并认识的一类水特异性膜内在蛋白，自1988年Agre等发现AQP1以来，在人体内已经陆续发现了11种类型的AQPs。人脑组织中主要有AQP1、AQP4，它们在瘤周水肿这一病理生理过程中的作用越来越收到人们的重视[9]。但是NPTX2、AQP3在胶质母细胞瘤组织中的表达情况未见系统报道。本实验研究发现，VEGF在中、高度瘤周水肿的肿瘤组织中未见明显差异表达，而差异表达明显且与瘤周水肿密切相关的基因是NPTX2、AQP3，提示胶质母细胞瘤瘤周水肿程度由中度向高度的转化过程中，VEGF并没有起到促进水肿的作用，而NPTX2、AQP3可能在这个转化过程中，起到了极为重要的作用。但是NPTX2与AQP3之间是否有关系，以及与VEGF是否有交叉的联系，目前仍不清楚，有待进一步的研究。
参考文献：
[1] Hiroko Ohgaki，Paul Kleihues. Epidemiology and etiology of glioma. Acta Neuropathol，2005，109：93. [2] Seidel C， Domer N，Osswald M，et a1. Does age matter？ - A MRI study on peritumoral edema in newly diagnosed primary glioblastoma.BMC Cancer， 2011 Apr 12；11：127
[3] 王建武，李靜，何宁.星形细胞瘤瘤周水肿的MRI、CT扫描的对比研究.中国临床医学影像杂志，2004， 15（7）：361-369.
[4] Razao I，Jeray K，Tomasz B，et al.Vascular endothelial growth factor and its receptor KDR， in human brain tissue after ischemic stroke.Lab，inest，1999，79 （4）： 417-424.
[5] Richard AB，Marsha JM，William CR，et al.Expression of the vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor gene in central nervous system neoplasms. Clin Invest，1993，91：153-159.
[6] Machein MR， Kulhner J， Ronicke V， et al. Differential downregulation of vascular endothelial growth factor by dexamethasone in normoxic and hypoxic rat glioma cells. Neuropathol Appl Neurtobiol，1999，25（2）：104-112.
[7] Pope WB， Lai A，Nghiemphu P，et al.MR imaging in patients with high grade gliomas treated with bevacizumab and chemotherapy.Neurology， 2006， 66：1258-1260.
[8] Schlimgen AK，Helm JA，Vogel H， et al. Neuronal pentraxin，a secreted protein with homology to acute phase proteins of the immune system. Neuron， 1995，14 （3）： 519-526.
[9] Chen YZ， Xu RX， Xu ZJ， et a1.Relationship between aquaporin-4 expression in astrocytes and brain edema caused by glioma. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2003， 23（6）：566-568.
【關键词】胶质母细胞瘤；瘤周水肿；基因芯片
【中图分类号】R739.41 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0142—02
胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性胶质瘤，传统的综合治疗后2年生存率仍不足10%[1]。瘤周水肿是胶质母细胞瘤最常见的磁共振图像特征。但是即使是同一病理级别的胶质母细胞瘤，其瘤周水肿程度也不尽相同，提示瘤周水肿可能有着内在的基因表达在起作用[2]。近几年基因芯片技术得到飞速发展，可同时检测数千钟至数万种基因的表达情况。高通量的特性，使得基因芯片技术在肿瘤的分子机制、分子分型、分子诊断、药理和毒理基因组学的研究中得到了广泛的应用。本文使用illumina表达谱芯片对30例胶质母细胞瘤样本进行了分析，筛选出差异表达基因，并结合磁共振图像，运用Spearman等级相关分析与瘤周水肿相关的差异基因。
1 材料与方法
1.1 病人资料
所有30例经病理证实为星形细胞瘤Ⅳ级的肿瘤标本，均取自于徐州医学院附属医院神经外科2009年5月-2012年12月手术中切除的肿瘤组织。胶质母细胞瘤患者中男性19例，女性11例，年龄32-74岁，平均52.1岁。患者术前均常规行磁共振T1、T2、T1增强和Flair像，根据瘤周水肿的大小分为无明显水肿、中度水肿（水肿范围在0-2 cm）、高度水肿（水肿范围>2 cm）三个级别，每个级别各10例。
1.2 基因芯片检测
通过Unizol法抽提30例胶质母细胞瘤总RNA，经质量鉴定合格后，反转录合成cDNA，对cDNA进行纯化后反转录合成cRNA，再对cRNA进行纯化，然后与illumina全基因组表达8-样本杂交，用BeadStation对杂交芯片进行扫描，利用cy3 （532nm）的荧光信号强度之间的关系计算出不同样本之间的差异性。
1.3 差异基因筛选标准
对差异基因的筛选标准是计算其diffsocre值，diffsocre≥40认为是上调基因，diffsocre≤-40认为是下调基因。
1.4 统计学分析
Spearman等级相关
2 结果
芯片扫描后，经过数据分析，瘤周水肿相关的差异基因主要为VEGF、AQP-3、AQP-4、NO、PDGF、NOS、MMP-9、NPTX2、HIF-1α、IGFBP-5、RBBP-8、PI3K、TXB2、HGF、IGF2R、PTEN、BAI3、TIMP1。
3 讨论
本实验发现，与瘤周水肿相关的差异中，大部分是促血管生成和抗血管生成基因。病理观察[3]发现新生的肿瘤细胞结构不完整，管壁薄弱，缺乏平滑肌，基底膜稀疏，易被肿瘤细胞穿透，这些特点影响血脑屏障的完整性，血浆和一些大分子物质可通过破损的血脑屏障渗透到细胞间隙，加之引流静脉被受压和侵蚀，回收水肿液功能降低，使其在瘤体周围聚集，形成瘤周水肿。
胶质母细胞瘤瘤周中、高度水肿与无明显水肿相比，VEGF的表达存在显著差异，VEGF与胶质母细胞瘤瘤周水肿存在正相关性。血管内皮生长因子（VEGF）是由胶质母细胞在体内分泌的较大量的特异性诱导血管渗透性、内皮细胞生长和血管生成的生长因子[4]，VEGF引起胶质母细胞瘤瘤周水肿的机理目前尚未完全明了。Richard[5]等证实在体内外人类多形性胶质母细胞瘤能产生VEGF，且由多形性胶质母细胞瘤细胞所诱导的渗透性多数由VEGF引起。Machein[6]等研究发现，糖皮质激素可抑制VEGF表达从而减轻胶质瘤瘤周水肿。进一步揭示出VEGF在胶质瘤瘤周水肿中的作用。Pope WB[7]等运用VEGF特异性抑制剂阿瓦斯丁来抑制肿瘤中VEGF的表达，能够见到瘤周水肿明显的减轻，也揭示了VEGF在瘤周水肿的形成中起到很重要的作用。但是不是所有的病人都对阿瓦斯丁敏感，水肿无明显的减轻，说明瘤周水肿的形成不是只有一条基因在起作用，很可能是多基因表达共同作用的结果。
神经元正五聚蛋白（Neuronal pentraxin，NP，NPTX），该蛋白有两个亚型，NPTX1和NPTX2[8]。NPTX1蛋白分布比较局限，仅神经元细胞可以分泌，要介导对降解的突触物质的摄取。与NPTX1不同，NPTX2的分布较广，在脑、肝脏、胰腺、心脏、骨骼肌和睾丸中均有表达。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是近几年来逐渐被发现并认识的一类水特异性膜内在蛋白，自1988年Agre等发现AQP1以来，在人体内已经陆续发现了11种类型的AQPs。人脑组织中主要有AQP1、AQP4，它们在瘤周水肿这一病理生理过程中的作用越来越收到人们的重视[9]。但是NPTX2、AQP3在胶质母细胞瘤组织中的表达情况未见系统报道。本实验研究发现，VEGF在中、高度瘤周水肿的肿瘤组织中未见明显差异表达，而差异表达明显且与瘤周水肿密切相关的基因是NPTX2、AQP3，提示胶质母细胞瘤瘤周水肿程度由中度向高度的转化过程中，VEGF并没有起到促进水肿的作用，而NPTX2、AQP3可能在这个转化过程中，起到了极为重要的作用。但是NPTX2与AQP3之间是否有关系，以及与VEGF是否有交叉的联系，目前仍不清楚，有待进一步的研究。
参考文献：
[1] Hiroko Ohgaki，Paul Kleihues. Epidemiology and etiology of glioma. Acta Neuropathol，2005，109：93. [2] Seidel C， Domer N，Osswald M，et a1. Does age matter？ - A MRI study on peritumoral edema in newly diagnosed primary glioblastoma.BMC Cancer， 2011 Apr 12；11：127
[3] 王建武，李靜，何宁.星形细胞瘤瘤周水肿的MRI、CT扫描的对比研究.中国临床医学影像杂志，2004， 15（7）：361-369.
[4] Razao I，Jeray K，Tomasz B，et al.Vascular endothelial growth factor and its receptor KDR， in human brain tissue after ischemic stroke.Lab，inest，1999，79 （4）： 417-424.
[5] Richard AB，Marsha JM，William CR，et al.Expression of the vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor gene in central nervous system neoplasms. Clin Invest，1993，91：153-159.
[6] Machein MR， Kulhner J， Ronicke V， et al. Differential downregulation of vascular endothelial growth factor by dexamethasone in normoxic and hypoxic rat glioma cells. Neuropathol Appl Neurtobiol，1999，25（2）：104-112.
[7] Pope WB， Lai A，Nghiemphu P，et al.MR imaging in patients with high grade gliomas treated with bevacizumab and chemotherapy.Neurology， 2006， 66：1258-1260.
[8] Schlimgen AK，Helm JA，Vogel H， et al. Neuronal pentraxin，a secreted protein with homology to acute phase proteins of the immune system. Neuron， 1995，14 （3）： 519-526.
[9] Chen YZ， Xu RX， Xu ZJ， et a1.Relationship between aquaporin-4 expression in astrocytes and brain edema caused by glioma. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2003， 23（6）：566-568.