论文部分内容阅读
摘 要：【目的】研究水稻茸毛发育机制及相关基因的功能与调控模式，为深入研究相关基因功能及其在生产上的应用提供理论支撑。【方法】从不同水稻品种中克隆叶片表皮毛发育相关基因GL6的启动子序列，并将具有显著表皮毛特征的突变体品种75-1-127的GL6基因启动子与叶表无显著表皮毛特征的野生型品种相应基因的启动子序列进行比对，同时克隆突变体品种75-1-127中GL6基因的CDS序列，并分别构建以玉米泛素蛋白Ubiquitin和花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子驱动的过表达载体，以农杆菌介导的方法转化野生型粳稻品种Kitaake。【结果】不同品种中克隆的启动子序列区存在显著的序列差异，以玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子驱动的过表达载体获得的转基因水稻出现了显著的表皮毛特征，以花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子驱动的过表达载体的转基因水稻则未出现典型的表皮毛特征。【结论】目标基因GL6的表达调控受启动子的影响，突变体品种75-1-127的叶表皮毛发育特征是因启动子区序列差异所致。
关键词：水稻;启动子;基因表达;表皮毛发育
中图分类号：S 511文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）02-139-07
0 引言
【研究意义】水稻是全世界最重要的粮食作物之一。水稻叶表茸毛通过影响其生长速率、光能利用效率等影响产量及某些生理学功能。近年来，多项研究已证明茸毛在植物与环境相互作用的过程中发挥了重要的作用。其中在调节植物能量与水分平衡[1-2]、抗辐射与机体组织保护[3-4]、叶片蒸腾与光合作用[5-6]等方面均有重要作用。此外，植物茸毛还通过栖息排斥和抵制产卵、觅食[7]、消化[8]等行为抵御昆虫入侵;还可通过分泌烷烃、酰基糖、倍半萜烯、酚类和一些其他化学物质来杀死、排斥昆虫[9]或抑制病原菌[7]，从而实现抗虫（病）的效果。植物表皮茸毛对植物的生长发育、生理过程及抗性均有重要影响，研究其形成及发育机制，尤其是研究其相关基因的功能与调控模式，对深入研究相关基因功能及其在生产上的应用具有重要意义。【前人研究进展】目前在拟南芥中，已经发现一系列与茸毛形成和发育相关的基因，如GIS[10]、MYB23[11]、GL3/EGL3[12-13]、TTG1[14]、GL1[15]、GL2[16]等，并且相關网络调控机制也逐渐被解析。在水稻等单子叶植物中，余四斌等[17]报道了一个AP2/ERF转录因子Hairy Leaf 6即HL6，该转录因子在水稻中控制表皮毛的伸长。进一步研究表明，HL6在表皮毛伸长中的调控作用主要依赖于OsWOX3B的功能[17]，OsWOX3B编码一个含同源结构域的蛋白，主要在表皮毛的起始中起关键作用[18]。酵母双杂试验和双分子荧光互补试验结果表明，HL6与OsWOX3B互作调控表皮毛的形成，并形成一个蛋白复合体以增强HL6和OsYUCCA5（与生长素相关）结合的能力。群体遗传分析表明，HL6在水稻驯化过程中受到了负选择[17]。除此之外，近年来很多与水稻茸毛发育相关的基因已被相继定位，如OsGL1和GL6被分别定位在水稻的5号和6号染色体上[19-20]，但其功能尚不明确。一些同源基因，如拟南芥中的OsTCL1基因与水稻中对应的同源基因OsTCL1/OsTCL2也被证明能够调控茸毛的生长[21]。然而，虽有证据表明双子叶植物具有相似的控制茸毛形成的机制，但郑楷杰等人利用拟南芥R3-MYB转录因子TRICHOMELESS1（TCL1）的完整氨基酸序列通过BLAST水稻参考基因组得到两个基因OsTCL1和OsTCL2，用转化拟南芥原生质体的方法转化OsTCL1基因后发现，在单子叶植物中并不适用[21]，OsTCL1并不能改变转基因水稻植株的表型，即通过与GL3互作从而抑制茸毛的形成[21]，这表明调控拟南芥茸毛形成的机制与水稻并不一致。因此，水稻茸毛发育机制及相关基因的功能与调控模式有待深入研究。转录水平的调控在植物基因表达调控中发挥重要作用，涉及多种顺式作用元件和反式作用因子。研究表明，不同启动子对相同基因的表达水平具有较大的差异，但在转基因植物中，组成型启动子持续过量表达外源基因会阻碍植物的生长且降低其产量[22]。【本研究切入点】基于水稻表皮毛形成和发育的机制尚不明确，本研究从基因的表达调控入手，解释基因的功能及调控网络，解析关键基因调控水稻表皮毛形成和发育的机理。【拟解决的关键问题】通过构建不同启动子驱动GL6基因的表达，获得不同启动子驱动下的目标基因GL6的阳性转基因植株，以研究不同启动子驱动下水稻茸毛生长发育的差异，分析启动子对基因的功能与表达模式的影响，以期望未来根据不同地理生态特点以及植物的生长需要，通过改变不同植物体表皮毛的分布及密度等特点，改善植物对环境的适应性，提高农作物在生产中的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 供试材料
叶表及种子颖壳表面具有明显表皮毛特征的籼稻品种75-1-127，普通籼稻品种明恢63（MH63）、粳稻品种Kitaake及美国光身稻品种Lemont，均由福建省农业科学院水稻研究所保存。水稻幼苗材料置于28℃，光周期16 h/8 h（光照/黑暗）的条件下进行培养。
1.2 试剂与载体质粒
Trizol试剂盒、大肠杆菌菌株Trans1-T1（DH5a）均购自全式金生物技术有限公司;农杆菌菌株EHA105、载体pCAMBIA-1301和pCUbi1390flag，均为本实验室保存。PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase（购自Vazyme），ReverTraAceqPCR RT Master Mix with gDNA Remover 逆转录试剂盒（购自TOYOBO），FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）荧光定量试剂盒（购买自ROCHE），Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System胶回收试剂盒（购自Promega），CV17-ZeroBackgroundpTOPO-BluntSimpleCloningKit平末端连接载体试剂盒（购自AIDLAB）;NANODROP2000C（购自Thermo），其他试剂均购自国药公司并由本实验室配制。 1.3 试验方法
1.3.1 GL6基因CDS序列的扩增
RNA 的提取参照Trizol试剂盒提供的实验方案进行操作，提取的 RNA 经过琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计NANODROP 2000C测定，检测其 RNA 质量（28S 和 18S 条带清晰明亮，A260∶280=2.0左右，且A260∶230≥1.8），随后将 RNA 进行 65℃热变性 5min 后立即置于冰上冷却，用逆转录试剂盒清除gDNA 后再反转录合成cDNA。反转后的cDNA用作GL6 CDS扩增的模板进行GL6（Loc_Os06g44750）基因的扩增。
1.3.2 GL6启动子预测与克隆
启动子序列的预测通过网站（PROSCAN∶https：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/ proscan/）进行预测，目的基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收正确的目的条带，用SVGel and PCR Clean-Up System试剂盒对目的条带进行纯化回收，获得纯化的目的条带。目的条带纯化后，用Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit转入大肠杆菌中进行转化，筛选阳性克隆并送至铂尚生物技术有限公司进行测序分析。
1.3.3 相关表达载体构建
构建CaMV35S驱动的pCAMBIA-1301和Ubiquitin驱动的pCUbi1390flag作为过表达载体，分别选择酶切位点（BglⅡ/BstEⅡ，Pst I）进行酶切回收，参照ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit连接试剂盒通过一步法连接到相应的过表达载体上，连接实验步骤参照厂商提供的说明书进行。
1.3.4 农杆菌介导水稻的遗传转化
先将构建好的载体质粒转化到农杆菌感受态细胞EHA105中，随后通过农杆菌介导的遗传转化法将相关载体进行遗传转化，获得相应的转基因植株。
1.3.5 转基因植株的PCR鉴定
先对获得的转基因植株进行潮霉素筛选，并提取所有待检测转基因植株叶片的DNA使用潮霉素引物进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测阳性率。
1.3.6 转基因植株表型观察与扫描电镜分析
对获得的阳性转基因植株进行叶片表面性状的观察，并将该叶片通过取样固定、脱水、干燥，以及喷金镀膜等程序后放置于扫描电镜（Hitachi S-4800，日本）下，分别观察叶片上、下表面及横断面的表型结构。
2 结果与分析
2.1 水稻表皮毛发育相关基因GL6的克隆与序列分析
本研究前期已成功将水稻茸毛发育相关基因GL6精细定位于水稻的6号染色体上，位于标记InDel-106和InDel-115的区间范围内，物理距离为79 kb。通过生物信息学分析，在粳稻日本晴的基因组中预测有7个预测基因，进一步分析的结果，将与相关茸毛基因同源性较近的2个基因及有已知功能的1个基因（Loc_Os06g44750、Loc_Os06g44810、Loc_Os06g44820）作为可能的目的基因，并分别对水稻品种75-1-127、MH63和日本晴进行相应基因的CDS序列扩增和序列比对分析（图1）。同时对这3个基因进行CDS及氨基酸序列的比对分析，结果发现： Loc_Os06g44750基因CDS序列在75-1-127与日本晴两个品种之间有2处碱基的差异;而与75-1-127相比，MH63中有6个碱基缺失，氨基酸序列比对结果分别是C替换为G，G替换为C，H替换为Q，NS的插入。Loc_Os06g44810基因在CDS序列比对中，同样有5个碱基的突变，氨基酸序列比对有3个氨基酸残基发生改变，分别是P 替换为L，T替换为A，F替换为 I。Loc_Os06g44820基因在CDS序列和氨基酸序列的比对上没有差异。据此，将Loc_Os06g44750和Loc_Os06g44810作为候选基因进行下一步的生物信息学分析。
生物信息学分析结果表明，Loc_Os06g44750基因的AP2 domain containing protein的基因结构域隶属于AP2/EREBP结构域成员，是三大转录因子家族成员之一，这类转录因子能专一性地结合GCC-Box结构域，类似在拟南芥中调控茸毛發育相关基因中的MYB转录因子（拟南芥MYB转录因子能专一地结合AtMyb域）。与已克隆基因HL6的结构与功能类似，因此将其确定为GL6的候选基因。
2.2 GL6启动子预测、克隆与序列比对
为了探究启动子是否影响了基因的表达，利用启动子预测网站对该基因CDS上游3 600 bp大小的基因片段作为该基因的启动子进行扩增，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测与回收。对GL6基因在75-1-127和MH63中启动子的序列差异比对结果（图2）表明，75-1-127和MH63在启动子序列上存在多处位点的碱基替换和序列缺失，该结果与文献[17]对W39和ZS97中HL6基因启动子的研究结果类似。
由此推测，启动子的差异很可能是造成基因功能差异的主要因素，与水稻表皮毛的形成和发育相关的基因，其调控网络中上、下游信号的级联放大对表皮毛在整个植物体形成过程中具有决定性作用，因此后续的研究需对启动子及调控网络中相关互作蛋白的关联做进一步的深入探究。
2.3 不同启动子驱动GL6过表达转基因植株的鉴定与观察
通过以上对启动子的克隆和序列分析，推测启动子的差异可能导致了水稻茸毛形成发育的差别，但控制茸毛形成发育的基因GL6却在不同亲本中的表达存在差异：在75-1-127、MH63和光身稻Lemont亲本中，GL6在75-1-127中的表达量高于MH63，而低于光身稻Lemont;在W39和ZS97亲本中，HL6基因的表达量W39显著高于ZS97[17];而在苏旺往尔、日本晴和宁稻1号亲本中，LOC_Os06g44750在苏旺往尔中的表达量较低，而在日本晴和宁稻1号中几乎不表达[17]。由此可知，不同亲本材料中基因的表达量对茸毛的形成及发育并不会造成直接的影响。 鉴此，分别构建了两个不同启动子驱动的过表达载体，完整的CDS序列来自75-1-127反转录产物扩增，所构建的载体为CaMV35S promoter∷pCAMBIA1301-GL6和Ubiquitin intron and promotor∷pCUBI1390-GL6，并应用农杆菌介导的方法，转化叶片无显著茸毛特征的粳稻品种Kitaake，获得了陽性的转基因植株（图3），结果发现，在CaMV35S promoter∷pCAMBIA1301-GL6转化获得的转基因植株中无典型的茸毛表型，而Ubiquitin intron and promotor∷pCUBI1390-GL6转化获得的转基因植株中有明显的茸毛表型，但茸毛长度较亲本75-1-127更短小，茸毛密度也更低（图4）。由此推测，茸毛的形成和发育可能与启动子驱动基因表达的强度有关。
3 讨 论
叶片一方面是植物进行光合作用最主要的器官，叶表形态及附属物对光合产物的形成具有重要的影响。另一方面，叶片表皮毛在植物与环境关系中，可通过影响植物的某些生理特性和抵御生物及非生物胁迫的能力，从而影响其生长状态和产量，是重要的农艺性状之一。克隆相关基因并进行功能及其调控网络的研究，有利于了解植物表皮毛形成和发育的分子机制。本研究前期通过图位克隆的方法克隆了水稻表皮毛发育相关基因GL6，发现其CDS区与普通水稻品种无差别，再分别克隆具有典型表皮毛表型及普通水稻的表皮毛发育相关基因的启动子区序列，通过序列比对发现，其在启动子区存在较大的差别，据此认为不同品种间存在叶表皮毛特征的差异可能是因为启动子区域的差别所影响。而前人的研究也发现，不同启动子或启动子串联组合驱动相同基因表达时，其表达水平可能会产生较大差异，对基因的表达可能具有决定性的作用。如乔龙飞等[23]克隆植物花发育关键基因正常和W-box突变2种启动子，并构建基因组DNA表达载体，发现目标基因LFY表达水平存在显著差异，所获得的转基因植株表现出明显不同的花期。这也进一步说明启动子对基因的表达具有极其重要的影响。
基于本研究所获得的结果及前人的研究基础，表明启动子对于水稻叶表皮毛发育相关基因GL6的表达和调控具有重要影响。在现代基因工程技术研究中，研究者为提高外源基因在植物中的表达水平，以花椰菜花叶病毒（CaMV） 35S启动子为对照，分别用玉米Ubiquitin启动子、水稻Actin启动子及水稻Oscc1启动子，通过启动子串联的方式构建表达载体转化水稻，发现不同启动子串联组合驱动的报告基因表达水平存在显著差异，在3种优化的启动子组合35S/Ubi、Ubi/Actin和Ubi /Oscc1中，以Ubi/Oscc1串联启动子驱动GFP的表达水平最高[24]。鉴于前人上述研究结果，为了更为清晰地揭示水稻表皮毛发育相关基因GL6在水稻表皮毛发育过程中的调控机制，分析该基因在不同启动子驱动下的过表达转基因植株表型，分别构建了以玉米泛素蛋白Ubiquitin和花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子驱动的过表达载体并转化水稻，结果表明，以玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子驱动的过表达载体转化叶片无显著茸毛特征的粳稻品种Kitaake后，出现了典型的叶表皮毛特征，而以花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子驱动的过表达载体转化粳稻品种Kitaake的转基因植株则未出现典型的叶表皮毛，这也证明了启动子对本研究的目标基因GL6 的功能及其调控水稻表皮毛发育的机制具有决定性的作用。本研究为继续深入剖析GL6基因的功能及其调控网络奠定了基础。此外，基因的表达模式和表达量可以通过启动子进行人为调控，这为植物表皮毛性状在植物育种及农业生产上的应用提供了理论依据，也为通过基因表达调控实现改善农作物农艺性状和提高产量提供了理论支撑。
参考文献：
[1]INOMURA K， BRAGG J， FOLLOWS M J. A quantitative analysis of the direct and indirect costs of nitrogen fixation： A model based on Azoto-bactervinelandii[J]. ISME J， 2017， 11： 166.
[2]LAUTER D J， MUNNS D N. Water loss via the glandular trichomes of chickpea （Cicer arietinum L.） [J]. J Exp Bot， 1986， 37： 640-649.
[3]YAN A， PAN J， AN L， et al. The responses of trichome mutants to enhanced ultraviolet-B radiation in Arabidopsis thaliana[J]. J PhotochemPhotobiol B Biol， 2012， 113： 29-35.
[4]TATTINI M， GRAVANO E， PINELLI P， et al. Flavonoids accumulate in leaves and glandular trichomes of Phillyrealatifolia exposed to excess solar radiation[J]. New Phytol， 2000， 148： 69-77.
[5]尚宏芹，刘建萍. 干旱胁迫下不同茸毛性状辣椒植株抗旱性比较[J]. 核农学报，2010，24（4）： 835-839.
SHANG H Q，LIU J P. Comparison of drought resistance of pepper with different hairiness character under drought stress[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2010，24（4）：835-839.（in Chinese） [6]CASTILLO-LPEZ J L， CANO-SANTANA Z， OYAMA K. Preferences and survival of Lophoceramicapyrrha， a shelter builder gregarious noctuid， in two host plants[J].Dugesiana， 2010， 17： 229-236.
[7]DALIN P， GREN J， BJRKMAN C， et al. Chapter 4：Leaf trichome formation and plant resistance to herbivory.Induced Plant Resistance to Herbivory[M]. Netherlands： Springer， 2008：89-105.
[8]MCGINNIS A J， KASTING R. Dietary cellulose： Effect on food consumption and growth of a grasshopper[J]. Ca J Zool， 2011， 45： 165-167.
[9]HANDLEY R， EKBOM B， AGREN J. Variation in trichome density and resistance against a specialist insect herbivore in natural populations of Arabidopsis thaliana[J]. EcolEntomol， 2005， 30： 284-292.
[10]AN L， ZHOU Z， SU S， et al. GLABROUS INFLORESCENCE STEMS （GIS） is required for trichome branching through gibberellic acid signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol， 2012， 53： 457.
[11]KHOSLA A， PAPER J M， BOEHLER A P， et al. HD-Zip proteins GL2 and HDG11 have redundant functions in Arabidopsis trichomes and GL2 activates a positive feedback loop via MYB23[J]. Plant Cell， 2014， 26： 2184-2200.
[12]MOROHASHI K， ZHAO M， YANG M， et al. Participation of the ArabidopsisbHLH factor GL3 in trichome initiation regulatory events[J]. Plant Physiol， 2007， 145： 736-746.
[13]BERNHARDT C， LEE M M， GONZALEZ ， et al.ThebHLH genes GLABRA3 （GL3） and ENHANCER OF GLABRA3 （EGL3） specify epidermal cell fate in the Arabidopsis root[J]. Development， 2003， 130： 6431-6439.
[14]CHOPRA D， WOLFF H， SPAN J， et al. Analysis of TTG1 function in Arabisalpina[J]. BMC Plant Biol， 2014， 14：16.
[15]LARKIN J C， OPPENHEIMER D G， MARKS M D， et al. The GL1 gene and the trichome developmental pathway in Arabidopsis thaliana[J]. Results Probl Cell Differ， 1994， 20： 259-275.
[16]SZYMANSKI D B， JILK R A， POLLOCK S M， et al. Control of GL2 expression in Arabidopsis leaves and trichomes[J]. Development， 1998， 125： 1161-1171.
[17]SUN W Q，GAO D W ，XIONG Y， et al.Hairy Leaf 6， an AP2/ERF Transcription Factor， Interacts with OsWOX3B and Regulates Trichome Formation in Rice[J].Molecular Plant，2017，10（11）：1417-1433.
[18]LI J J ， YUAN Y D，LU Z F， et al. Glabrous Rice 1， encoding a homeodomainprotein， regulates trichome development in rice[J].Rice，2012，5（32）：1-10.
[19]QIN B， TANG D， HUANG J， et al. Rice OsGL1-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane[J]. Mol Plant， 2011， 4： 985-995.
[20]曾躍辉，朱永生，连玲，等. 水稻茸毛基因GL6的遗传学分析与精细定位[J]. 科学通报，2013，58（1）：1027-1035. ZENG Y H， ZHU Y S， LIAN L， et al.Genetic analysis and fine mapping of the pubescence gene GL6 in rice （Oryzae sativa L.）[J].Chinese Science Bulletin，2013，58（1）：1-8.（in Chinese）
[21]ZHENG K， TIAN H， HU Q ， et al. Ectopic expression of R3MYB transcription factor gene OsTCL1 in Arabidopsis， but not rice， affects trichome and root hair formation[J]. Sci Rep， 2016， 6： 19254.
[22]KASUGA M，LIU Q，MIURA S， et al. Improving plant drought， salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J]. Nat biotechnol， 1999，17（3）：287-291
[23]喬龙飞， 于延冲.LEAFY启动子中W-box对LEAFY表达及拟南芥开花的影响[J].植物生理学报，2017， 53 （4）： 713-720.
QIAO L F，YU Y C. Effect of W-box in LEAFY promoter on LEAFY expression and Arabidopsis flowering[J]. Plant Physiology Journal，2017， 53 （4）： 713-720.（in Chinese）
[24]陈兆骞，陈熙，张炜，不同启动子在水稻悬浮细胞中诱导外源基因的表达，江苏农业学报[J]，2014，30（6）： 1208-1215.
CHEN Z Q ，CHEN X， ZHANG W， et al. Promoter-induced expression of exogenous gene in rice suspension cell lines[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，2014，30（6）：1208-1215.（in Chinese）
（责任编辑：杨小萍）
关键词：水稻;启动子;基因表达;表皮毛发育
中图分类号：S 511文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）02-139-07
0 引言
【研究意义】水稻是全世界最重要的粮食作物之一。水稻叶表茸毛通过影响其生长速率、光能利用效率等影响产量及某些生理学功能。近年来，多项研究已证明茸毛在植物与环境相互作用的过程中发挥了重要的作用。其中在调节植物能量与水分平衡[1-2]、抗辐射与机体组织保护[3-4]、叶片蒸腾与光合作用[5-6]等方面均有重要作用。此外，植物茸毛还通过栖息排斥和抵制产卵、觅食[7]、消化[8]等行为抵御昆虫入侵;还可通过分泌烷烃、酰基糖、倍半萜烯、酚类和一些其他化学物质来杀死、排斥昆虫[9]或抑制病原菌[7]，从而实现抗虫（病）的效果。植物表皮茸毛对植物的生长发育、生理过程及抗性均有重要影响，研究其形成及发育机制，尤其是研究其相关基因的功能与调控模式，对深入研究相关基因功能及其在生产上的应用具有重要意义。【前人研究进展】目前在拟南芥中，已经发现一系列与茸毛形成和发育相关的基因，如GIS[10]、MYB23[11]、GL3/EGL3[12-13]、TTG1[14]、GL1[15]、GL2[16]等，并且相關网络调控机制也逐渐被解析。在水稻等单子叶植物中，余四斌等[17]报道了一个AP2/ERF转录因子Hairy Leaf 6即HL6，该转录因子在水稻中控制表皮毛的伸长。进一步研究表明，HL6在表皮毛伸长中的调控作用主要依赖于OsWOX3B的功能[17]，OsWOX3B编码一个含同源结构域的蛋白，主要在表皮毛的起始中起关键作用[18]。酵母双杂试验和双分子荧光互补试验结果表明，HL6与OsWOX3B互作调控表皮毛的形成，并形成一个蛋白复合体以增强HL6和OsYUCCA5（与生长素相关）结合的能力。群体遗传分析表明，HL6在水稻驯化过程中受到了负选择[17]。除此之外，近年来很多与水稻茸毛发育相关的基因已被相继定位，如OsGL1和GL6被分别定位在水稻的5号和6号染色体上[19-20]，但其功能尚不明确。一些同源基因，如拟南芥中的OsTCL1基因与水稻中对应的同源基因OsTCL1/OsTCL2也被证明能够调控茸毛的生长[21]。然而，虽有证据表明双子叶植物具有相似的控制茸毛形成的机制，但郑楷杰等人利用拟南芥R3-MYB转录因子TRICHOMELESS1（TCL1）的完整氨基酸序列通过BLAST水稻参考基因组得到两个基因OsTCL1和OsTCL2，用转化拟南芥原生质体的方法转化OsTCL1基因后发现，在单子叶植物中并不适用[21]，OsTCL1并不能改变转基因水稻植株的表型，即通过与GL3互作从而抑制茸毛的形成[21]，这表明调控拟南芥茸毛形成的机制与水稻并不一致。因此，水稻茸毛发育机制及相关基因的功能与调控模式有待深入研究。转录水平的调控在植物基因表达调控中发挥重要作用，涉及多种顺式作用元件和反式作用因子。研究表明，不同启动子对相同基因的表达水平具有较大的差异，但在转基因植物中，组成型启动子持续过量表达外源基因会阻碍植物的生长且降低其产量[22]。【本研究切入点】基于水稻表皮毛形成和发育的机制尚不明确，本研究从基因的表达调控入手，解释基因的功能及调控网络，解析关键基因调控水稻表皮毛形成和发育的机理。【拟解决的关键问题】通过构建不同启动子驱动GL6基因的表达，获得不同启动子驱动下的目标基因GL6的阳性转基因植株，以研究不同启动子驱动下水稻茸毛生长发育的差异，分析启动子对基因的功能与表达模式的影响，以期望未来根据不同地理生态特点以及植物的生长需要，通过改变不同植物体表皮毛的分布及密度等特点，改善植物对环境的适应性，提高农作物在生产中的应用潜力。
1 材料与方法
1.1 供试材料
叶表及种子颖壳表面具有明显表皮毛特征的籼稻品种75-1-127，普通籼稻品种明恢63（MH63）、粳稻品种Kitaake及美国光身稻品种Lemont，均由福建省农业科学院水稻研究所保存。水稻幼苗材料置于28℃，光周期16 h/8 h（光照/黑暗）的条件下进行培养。
1.2 试剂与载体质粒
Trizol试剂盒、大肠杆菌菌株Trans1-T1（DH5a）均购自全式金生物技术有限公司;农杆菌菌株EHA105、载体pCAMBIA-1301和pCUbi1390flag，均为本实验室保存。PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase（购自Vazyme），ReverTraAceqPCR RT Master Mix with gDNA Remover 逆转录试剂盒（购自TOYOBO），FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）荧光定量试剂盒（购买自ROCHE），Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System胶回收试剂盒（购自Promega），CV17-ZeroBackgroundpTOPO-BluntSimpleCloningKit平末端连接载体试剂盒（购自AIDLAB）;NANODROP2000C（购自Thermo），其他试剂均购自国药公司并由本实验室配制。 1.3 试验方法
1.3.1 GL6基因CDS序列的扩增
RNA 的提取参照Trizol试剂盒提供的实验方案进行操作，提取的 RNA 经过琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计NANODROP 2000C测定，检测其 RNA 质量（28S 和 18S 条带清晰明亮，A260∶280=2.0左右，且A260∶230≥1.8），随后将 RNA 进行 65℃热变性 5min 后立即置于冰上冷却，用逆转录试剂盒清除gDNA 后再反转录合成cDNA。反转后的cDNA用作GL6 CDS扩增的模板进行GL6（Loc_Os06g44750）基因的扩增。
1.3.2 GL6启动子预测与克隆
启动子序列的预测通过网站（PROSCAN∶https：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/ proscan/）进行预测，目的基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收正确的目的条带，用SVGel and PCR Clean-Up System试剂盒对目的条带进行纯化回收，获得纯化的目的条带。目的条带纯化后，用Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit转入大肠杆菌中进行转化，筛选阳性克隆并送至铂尚生物技术有限公司进行测序分析。
1.3.3 相关表达载体构建
构建CaMV35S驱动的pCAMBIA-1301和Ubiquitin驱动的pCUbi1390flag作为过表达载体，分别选择酶切位点（BglⅡ/BstEⅡ，Pst I）进行酶切回收，参照ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit连接试剂盒通过一步法连接到相应的过表达载体上，连接实验步骤参照厂商提供的说明书进行。
1.3.4 农杆菌介导水稻的遗传转化
先将构建好的载体质粒转化到农杆菌感受态细胞EHA105中，随后通过农杆菌介导的遗传转化法将相关载体进行遗传转化，获得相应的转基因植株。
1.3.5 转基因植株的PCR鉴定
先对获得的转基因植株进行潮霉素筛选，并提取所有待检测转基因植株叶片的DNA使用潮霉素引物进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳检测阳性率。
1.3.6 转基因植株表型观察与扫描电镜分析
对获得的阳性转基因植株进行叶片表面性状的观察，并将该叶片通过取样固定、脱水、干燥，以及喷金镀膜等程序后放置于扫描电镜（Hitachi S-4800，日本）下，分别观察叶片上、下表面及横断面的表型结构。
2 结果与分析
2.1 水稻表皮毛发育相关基因GL6的克隆与序列分析
本研究前期已成功将水稻茸毛发育相关基因GL6精细定位于水稻的6号染色体上，位于标记InDel-106和InDel-115的区间范围内，物理距离为79 kb。通过生物信息学分析，在粳稻日本晴的基因组中预测有7个预测基因，进一步分析的结果，将与相关茸毛基因同源性较近的2个基因及有已知功能的1个基因（Loc_Os06g44750、Loc_Os06g44810、Loc_Os06g44820）作为可能的目的基因，并分别对水稻品种75-1-127、MH63和日本晴进行相应基因的CDS序列扩增和序列比对分析（图1）。同时对这3个基因进行CDS及氨基酸序列的比对分析，结果发现： Loc_Os06g44750基因CDS序列在75-1-127与日本晴两个品种之间有2处碱基的差异;而与75-1-127相比，MH63中有6个碱基缺失，氨基酸序列比对结果分别是C替换为G，G替换为C，H替换为Q，NS的插入。Loc_Os06g44810基因在CDS序列比对中，同样有5个碱基的突变，氨基酸序列比对有3个氨基酸残基发生改变，分别是P 替换为L，T替换为A，F替换为 I。Loc_Os06g44820基因在CDS序列和氨基酸序列的比对上没有差异。据此，将Loc_Os06g44750和Loc_Os06g44810作为候选基因进行下一步的生物信息学分析。
生物信息学分析结果表明，Loc_Os06g44750基因的AP2 domain containing protein的基因结构域隶属于AP2/EREBP结构域成员，是三大转录因子家族成员之一，这类转录因子能专一性地结合GCC-Box结构域，类似在拟南芥中调控茸毛發育相关基因中的MYB转录因子（拟南芥MYB转录因子能专一地结合AtMyb域）。与已克隆基因HL6的结构与功能类似，因此将其确定为GL6的候选基因。
2.2 GL6启动子预测、克隆与序列比对
为了探究启动子是否影响了基因的表达，利用启动子预测网站对该基因CDS上游3 600 bp大小的基因片段作为该基因的启动子进行扩增，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测与回收。对GL6基因在75-1-127和MH63中启动子的序列差异比对结果（图2）表明，75-1-127和MH63在启动子序列上存在多处位点的碱基替换和序列缺失，该结果与文献[17]对W39和ZS97中HL6基因启动子的研究结果类似。
由此推测，启动子的差异很可能是造成基因功能差异的主要因素，与水稻表皮毛的形成和发育相关的基因，其调控网络中上、下游信号的级联放大对表皮毛在整个植物体形成过程中具有决定性作用，因此后续的研究需对启动子及调控网络中相关互作蛋白的关联做进一步的深入探究。
2.3 不同启动子驱动GL6过表达转基因植株的鉴定与观察
通过以上对启动子的克隆和序列分析，推测启动子的差异可能导致了水稻茸毛形成发育的差别，但控制茸毛形成发育的基因GL6却在不同亲本中的表达存在差异：在75-1-127、MH63和光身稻Lemont亲本中，GL6在75-1-127中的表达量高于MH63，而低于光身稻Lemont;在W39和ZS97亲本中，HL6基因的表达量W39显著高于ZS97[17];而在苏旺往尔、日本晴和宁稻1号亲本中，LOC_Os06g44750在苏旺往尔中的表达量较低，而在日本晴和宁稻1号中几乎不表达[17]。由此可知，不同亲本材料中基因的表达量对茸毛的形成及发育并不会造成直接的影响。 鉴此，分别构建了两个不同启动子驱动的过表达载体，完整的CDS序列来自75-1-127反转录产物扩增，所构建的载体为CaMV35S promoter∷pCAMBIA1301-GL6和Ubiquitin intron and promotor∷pCUBI1390-GL6，并应用农杆菌介导的方法，转化叶片无显著茸毛特征的粳稻品种Kitaake，获得了陽性的转基因植株（图3），结果发现，在CaMV35S promoter∷pCAMBIA1301-GL6转化获得的转基因植株中无典型的茸毛表型，而Ubiquitin intron and promotor∷pCUBI1390-GL6转化获得的转基因植株中有明显的茸毛表型，但茸毛长度较亲本75-1-127更短小，茸毛密度也更低（图4）。由此推测，茸毛的形成和发育可能与启动子驱动基因表达的强度有关。
3 讨 论
叶片一方面是植物进行光合作用最主要的器官，叶表形态及附属物对光合产物的形成具有重要的影响。另一方面，叶片表皮毛在植物与环境关系中，可通过影响植物的某些生理特性和抵御生物及非生物胁迫的能力，从而影响其生长状态和产量，是重要的农艺性状之一。克隆相关基因并进行功能及其调控网络的研究，有利于了解植物表皮毛形成和发育的分子机制。本研究前期通过图位克隆的方法克隆了水稻表皮毛发育相关基因GL6，发现其CDS区与普通水稻品种无差别，再分别克隆具有典型表皮毛表型及普通水稻的表皮毛发育相关基因的启动子区序列，通过序列比对发现，其在启动子区存在较大的差别，据此认为不同品种间存在叶表皮毛特征的差异可能是因为启动子区域的差别所影响。而前人的研究也发现，不同启动子或启动子串联组合驱动相同基因表达时，其表达水平可能会产生较大差异，对基因的表达可能具有决定性的作用。如乔龙飞等[23]克隆植物花发育关键基因正常和W-box突变2种启动子，并构建基因组DNA表达载体，发现目标基因LFY表达水平存在显著差异，所获得的转基因植株表现出明显不同的花期。这也进一步说明启动子对基因的表达具有极其重要的影响。
基于本研究所获得的结果及前人的研究基础，表明启动子对于水稻叶表皮毛发育相关基因GL6的表达和调控具有重要影响。在现代基因工程技术研究中，研究者为提高外源基因在植物中的表达水平，以花椰菜花叶病毒（CaMV） 35S启动子为对照，分别用玉米Ubiquitin启动子、水稻Actin启动子及水稻Oscc1启动子，通过启动子串联的方式构建表达载体转化水稻，发现不同启动子串联组合驱动的报告基因表达水平存在显著差异，在3种优化的启动子组合35S/Ubi、Ubi/Actin和Ubi /Oscc1中，以Ubi/Oscc1串联启动子驱动GFP的表达水平最高[24]。鉴于前人上述研究结果，为了更为清晰地揭示水稻表皮毛发育相关基因GL6在水稻表皮毛发育过程中的调控机制，分析该基因在不同启动子驱动下的过表达转基因植株表型，分别构建了以玉米泛素蛋白Ubiquitin和花椰菜花叶病毒CaMV35S为启动子驱动的过表达载体并转化水稻，结果表明，以玉米泛素蛋白Ubiquitin启动子驱动的过表达载体转化叶片无显著茸毛特征的粳稻品种Kitaake后，出现了典型的叶表皮毛特征，而以花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子驱动的过表达载体转化粳稻品种Kitaake的转基因植株则未出现典型的叶表皮毛，这也证明了启动子对本研究的目标基因GL6 的功能及其调控水稻表皮毛发育的机制具有决定性的作用。本研究为继续深入剖析GL6基因的功能及其调控网络奠定了基础。此外，基因的表达模式和表达量可以通过启动子进行人为调控，这为植物表皮毛性状在植物育种及农业生产上的应用提供了理论依据，也为通过基因表达调控实现改善农作物农艺性状和提高产量提供了理论支撑。
参考文献：
[1]INOMURA K， BRAGG J， FOLLOWS M J. A quantitative analysis of the direct and indirect costs of nitrogen fixation： A model based on Azoto-bactervinelandii[J]. ISME J， 2017， 11： 166.
[2]LAUTER D J， MUNNS D N. Water loss via the glandular trichomes of chickpea （Cicer arietinum L.） [J]. J Exp Bot， 1986， 37： 640-649.
[3]YAN A， PAN J， AN L， et al. The responses of trichome mutants to enhanced ultraviolet-B radiation in Arabidopsis thaliana[J]. J PhotochemPhotobiol B Biol， 2012， 113： 29-35.
[4]TATTINI M， GRAVANO E， PINELLI P， et al. Flavonoids accumulate in leaves and glandular trichomes of Phillyrealatifolia exposed to excess solar radiation[J]. New Phytol， 2000， 148： 69-77.
[5]尚宏芹，刘建萍. 干旱胁迫下不同茸毛性状辣椒植株抗旱性比较[J]. 核农学报，2010，24（4）： 835-839.
SHANG H Q，LIU J P. Comparison of drought resistance of pepper with different hairiness character under drought stress[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2010，24（4）：835-839.（in Chinese） [6]CASTILLO-LPEZ J L， CANO-SANTANA Z， OYAMA K. Preferences and survival of Lophoceramicapyrrha， a shelter builder gregarious noctuid， in two host plants[J].Dugesiana， 2010， 17： 229-236.
[7]DALIN P， GREN J， BJRKMAN C， et al. Chapter 4：Leaf trichome formation and plant resistance to herbivory.Induced Plant Resistance to Herbivory[M]. Netherlands： Springer， 2008：89-105.
[8]MCGINNIS A J， KASTING R. Dietary cellulose： Effect on food consumption and growth of a grasshopper[J]. Ca J Zool， 2011， 45： 165-167.
[9]HANDLEY R， EKBOM B， AGREN J. Variation in trichome density and resistance against a specialist insect herbivore in natural populations of Arabidopsis thaliana[J]. EcolEntomol， 2005， 30： 284-292.
[10]AN L， ZHOU Z， SU S， et al. GLABROUS INFLORESCENCE STEMS （GIS） is required for trichome branching through gibberellic acid signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol， 2012， 53： 457.
[11]KHOSLA A， PAPER J M， BOEHLER A P， et al. HD-Zip proteins GL2 and HDG11 have redundant functions in Arabidopsis trichomes and GL2 activates a positive feedback loop via MYB23[J]. Plant Cell， 2014， 26： 2184-2200.
[12]MOROHASHI K， ZHAO M， YANG M， et al. Participation of the ArabidopsisbHLH factor GL3 in trichome initiation regulatory events[J]. Plant Physiol， 2007， 145： 736-746.
[13]BERNHARDT C， LEE M M， GONZALEZ ， et al.ThebHLH genes GLABRA3 （GL3） and ENHANCER OF GLABRA3 （EGL3） specify epidermal cell fate in the Arabidopsis root[J]. Development， 2003， 130： 6431-6439.
[14]CHOPRA D， WOLFF H， SPAN J， et al. Analysis of TTG1 function in Arabisalpina[J]. BMC Plant Biol， 2014， 14：16.
[15]LARKIN J C， OPPENHEIMER D G， MARKS M D， et al. The GL1 gene and the trichome developmental pathway in Arabidopsis thaliana[J]. Results Probl Cell Differ， 1994， 20： 259-275.
[16]SZYMANSKI D B， JILK R A， POLLOCK S M， et al. Control of GL2 expression in Arabidopsis leaves and trichomes[J]. Development， 1998， 125： 1161-1171.
[17]SUN W Q，GAO D W ，XIONG Y， et al.Hairy Leaf 6， an AP2/ERF Transcription Factor， Interacts with OsWOX3B and Regulates Trichome Formation in Rice[J].Molecular Plant，2017，10（11）：1417-1433.
[18]LI J J ， YUAN Y D，LU Z F， et al. Glabrous Rice 1， encoding a homeodomainprotein， regulates trichome development in rice[J].Rice，2012，5（32）：1-10.
[19]QIN B， TANG D， HUANG J， et al. Rice OsGL1-1 is involved in leaf cuticular wax and cuticle membrane[J]. Mol Plant， 2011， 4： 985-995.
[20]曾躍辉，朱永生，连玲，等. 水稻茸毛基因GL6的遗传学分析与精细定位[J]. 科学通报，2013，58（1）：1027-1035. ZENG Y H， ZHU Y S， LIAN L， et al.Genetic analysis and fine mapping of the pubescence gene GL6 in rice （Oryzae sativa L.）[J].Chinese Science Bulletin，2013，58（1）：1-8.（in Chinese）
[21]ZHENG K， TIAN H， HU Q ， et al. Ectopic expression of R3MYB transcription factor gene OsTCL1 in Arabidopsis， but not rice， affects trichome and root hair formation[J]. Sci Rep， 2016， 6： 19254.
[22]KASUGA M，LIU Q，MIURA S， et al. Improving plant drought， salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J]. Nat biotechnol， 1999，17（3）：287-291
[23]喬龙飞， 于延冲.LEAFY启动子中W-box对LEAFY表达及拟南芥开花的影响[J].植物生理学报，2017， 53 （4）： 713-720.
QIAO L F，YU Y C. Effect of W-box in LEAFY promoter on LEAFY expression and Arabidopsis flowering[J]. Plant Physiology Journal，2017， 53 （4）： 713-720.（in Chinese）
[24]陈兆骞，陈熙，张炜，不同启动子在水稻悬浮细胞中诱导外源基因的表达，江苏农业学报[J]，2014，30（6）： 1208-1215.
CHEN Z Q ，CHEN X， ZHANG W， et al. Promoter-induced expression of exogenous gene in rice suspension cell lines[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，2014，30（6）：1208-1215.（in Chinese）
（责任编辑：杨小萍）