论文部分内容阅读
摘 要：以阿维菌素浓度为响应值，采用响应面法对阿维菌素产生菌培养基成分进行了优化。在单因素试验的基础上，选取玉米淀粉浓度、硫酸铵浓度和丙酸钠浓度等3个因素进行了Box-Behnken试验。结果表明，3个因素对阿维菌素浓度的影响显著，最佳培养基组成为：玉米淀粉35.45g/L，硫酸铵16.27g/L，丙酸钠1.56g/L。在此条件下，阿维菌素的浓度达4.492g/L。
关键词：培养基;优化;响应面法;阿维菌素
中图分类号 TQ920.6 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）21-0036-04
Abstract：Taking the Avermectin concentration as the response value，the medium composition for producing strain of Avermectin was optimized by response surface methodology. Study three factors such as corn starch concentration，ammonium sulfate concentration，and sodium propionate concentration by the Box-Behnken response surface test，based on the single factor experiment. Results showed that three factors had all significant effect on the Avermectin concentration，corn starch concentration was 35.45g/L，ammonium sulfate concentration was 16.27g/L，sodium propionate concentration was 1.56g/L. Under the above conditions，the Avermectin concentration was 4.492g/L.
Key words：Medium;Optimization;Response surface methodology;Avermectin
阿维菌素（Avermectins，AVM）是由阿维链霉菌产生的十六元大环内酯类化合物[1]，具有高效、低毒、安全的特点[2]，已成为了一种广泛应用于农、林和养殖业的生物源杀虫、杀螨剂[3]。由于阿维链霉菌的生长特性，只能使用分批发酵作为主要生产方式，导致每批次不同发酵罐中阿维菌素的产量都会因菌种退化、延滞期长短不一、碳氮源流加需求变化等而出现了较大的差异。这种差异在一定程度上限制了阿维菌素的提取和精制，增加了生产成本。因此，通过改造阿维菌素产生菌的菌种和优化发酵工艺来提高阿维菌素产量，越来越受到重视[4-7]。本研究在单因素试验的基础上，通过响应面法优化阿维菌素产生菌培养基成分，得到其最佳配方组成，为阿维菌素产生菌复壮、选育及阿维菌素工业生产提供支持。
1 材料与方法
1.1 试验菌种 试验菌株由大庆志飞生物化工有限公司提供。
1.2 培养基 种子培养基：可溶性淀粉20g/L、酵母浸粉8g/L，α-淀粉酶0.04g/L、七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾4g/L、磷酸氢二铵0.5g/L、二水合氯化钙1.8g/L、六水合氯化钴0.005g/L、pH7.0-7.2。发酵培养基：玉米淀粉10g/L、α-淀粉酶0.04g/L、七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾4g/L、硫酸铵15g/L、丙酸钠0.6g/L、二水合氯化钙1.8g/L、六水合氯化钴0.005g/L、pH7.0～7.2。
1.3 培养方法 挑取单菌落菌种孢子接种于种子培养基中，28℃培养48h，按5%的接种量接种于摇瓶培养基，28℃培养14d，放瓶测定。
1.4 阿维菌素标准曲线 准确称取阿维菌素标准品0.1g，以甲醇为溶剂配制成浓度为100μg/mL的母液，依次稀释获得浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL的阿维菌素溶液，在245nm处测得其吸光度OD值，反復实验3次取平均值。以阿维菌素浓度为横坐标，平均吸光度值为纵坐标，构建标准曲线。所绘标准曲线见图1。
1.5 单因素试验 在前期试验的基础上，其他条件保持不变，分别选择玉米淀粉浓度（10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L）、硫酸铵浓度（10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L）和丙酸钠浓度（0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L）3个因素进行单因素试验，考察各因素对阿维菌素浓度的影响。
1.6 响应面试验 根据单因素试验结果，采用3因素3水平Box-Behnken中心组合试验设计，考察玉米淀粉、硫酸铵及丙酸钠浓度对阿维菌素浓度的影响。
2 结果与分析
2.1 单因素试验对阿维菌素浓度的影响
2.1.1 玉米淀粉 由图2可知，随着玉米淀粉浓度的增加，阿维菌素浓度先增加后减少，在玉米淀粉浓度35g/L时，阿维菌素浓度达到最高。
2.1.2 硫酸铵 由图3可知，硫酸铵浓度在16g/L时，阿维菌素浓度达到最高。 2.1.3 丙酸钠 发酵过程中在培养基内加入一定浓度的前体物质丙酸钠，可显著提高发酵产量[8]。由图4可知，随着丙酸钠浓度的增加，阿维菌素浓度先增加后减少，在丙酸钠浓度为1.4g/L时，阿维菌素浓度达到最高。
2.2 Box-Behnken试验结果 根据单因素试验结果，以阿维菌素浓度（Y）为响应值，选取玉米淀粉浓度（A）、硫酸铵浓度（B）、丙酸钠浓度（C）3个因素进行了3因素3水平的Box-Behnken试验，响应面试验因素及水平表见表1，试验设计及结果见表2。
根据表2中试验结果，利用Design-Expert V8.06分析软件对表2试验结果进行二次回归分析，获得回归方程：
Y=4.45+0.14A+0.1B-0.11C+0.21AB+0.21AC-0.22BC-0.71A2-0.6B2-0.31C2
对二次多元回归模型进行方差分析，结果见表3。回归模型显著性检验和方差分析结果表明，模型P值<0.0001，拟合模型极显著，失拟项的P值为0.1119，大于0.05，差异不显著，说明此模型合理，拟合较好。该模型的相关系数和调整相关系数分别为R2=0.9823和R2Adj=0.9595，拟合模型能解释95.95%的响应值的改变。一次项A、B、C，交互项AB、AC、BC，二次项A2、B2、C2对结果影响显著（P<0.05）。
表3中F值反映各因素对阿维菌素浓度的影响强度，A>C>B，即玉米淀粉浓度>丙酸钠浓度>硫酸铵浓度。各因素交互作用响应面曲线图见图5～7。
通过Design-Expert V8.06软件分析得到最佳培养基组成如下：玉米淀粉浓度35.45g/L，硫酸铵浓度16.27g/L，丙酸钠浓度1.56g/L，阿维菌素浓度的理论预测值为4.477g/L。为了验证模型的准确性，采取优化后的培养基条件做验证试验，进行3次平行试验，得到阿维菌素浓度分别为4.502g/L、4.475g/L、4.498g/L，预测值与实测值较接近。说明用二次多项式数学模型进行优化符合设计目标，试验设计和数学模型具有可靠性和重现性。
3 结论
通过Box-Behnken响应面设计试验和分析，玉米淀粉浓度、硫酸铵浓度和丙酸钠浓度3个因素对阿维菌素浓度影响均显著;据此建立了影响阿维菌素浓度的二次多项回归方程模型，得到最佳培养基配方组成如下：玉米淀粉35.45g/L，硫酸铵16.27g/L，丙酸钠1.56g/L，在此条件下，阿维菌素浓度达4.492g/L。研究结果可对企业的实际生产提供理论依据。
参考文献
[1]李卫平.阿维菌素的研究进展[J].中国药业，2012，21（19）：108-110.
[2]李铭，冯伟，崔玉，等.阿维菌素类药物毒理学研究进展[J].安徽農学通报，2013，19（20）：29-32，39.
[3]陈振.阿维菌素衍生物设计、合成及杀虫活性研究[D].杭州：浙江农林大学，2016.
[4]何栋栋.阿维菌素高产菌株的诱变筛选及生产工艺的优化[D].天津：天津大学，2011.
[5]梁剑光，储消和，储炬，等.响应面法优化阿维菌素B1a生产菌株复合发酵培养基[J].中国医药工业杂志，2013，44（10）：986-988，1004.
[6]田萍萍，曹鹏，常传友，等.阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化[J].微生物学通报，2017，44（01）：150-160.
[7]胡栋，柯灵超，张敬宇，等.响应面法设计优化阿维菌素化学合成发酵培养基[J].中国抗生素杂志，2018，43（08）：1055-1061.
[8]李燕霞.阿维菌素产生菌培养条件的优化[J].河北化工，2009，32（03）：55-58.
（责编：张宏民）
关键词：培养基;优化;响应面法;阿维菌素
中图分类号 TQ920.6 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）21-0036-04
Abstract：Taking the Avermectin concentration as the response value，the medium composition for producing strain of Avermectin was optimized by response surface methodology. Study three factors such as corn starch concentration，ammonium sulfate concentration，and sodium propionate concentration by the Box-Behnken response surface test，based on the single factor experiment. Results showed that three factors had all significant effect on the Avermectin concentration，corn starch concentration was 35.45g/L，ammonium sulfate concentration was 16.27g/L，sodium propionate concentration was 1.56g/L. Under the above conditions，the Avermectin concentration was 4.492g/L.
Key words：Medium;Optimization;Response surface methodology;Avermectin
阿维菌素（Avermectins，AVM）是由阿维链霉菌产生的十六元大环内酯类化合物[1]，具有高效、低毒、安全的特点[2]，已成为了一种广泛应用于农、林和养殖业的生物源杀虫、杀螨剂[3]。由于阿维链霉菌的生长特性，只能使用分批发酵作为主要生产方式，导致每批次不同发酵罐中阿维菌素的产量都会因菌种退化、延滞期长短不一、碳氮源流加需求变化等而出现了较大的差异。这种差异在一定程度上限制了阿维菌素的提取和精制，增加了生产成本。因此，通过改造阿维菌素产生菌的菌种和优化发酵工艺来提高阿维菌素产量，越来越受到重视[4-7]。本研究在单因素试验的基础上，通过响应面法优化阿维菌素产生菌培养基成分，得到其最佳配方组成，为阿维菌素产生菌复壮、选育及阿维菌素工业生产提供支持。
1 材料与方法
1.1 试验菌种 试验菌株由大庆志飞生物化工有限公司提供。
1.2 培养基 种子培养基：可溶性淀粉20g/L、酵母浸粉8g/L，α-淀粉酶0.04g/L、七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾4g/L、磷酸氢二铵0.5g/L、二水合氯化钙1.8g/L、六水合氯化钴0.005g/L、pH7.0-7.2。发酵培养基：玉米淀粉10g/L、α-淀粉酶0.04g/L、七水硫酸镁0.5g/L，氯化钾4g/L、硫酸铵15g/L、丙酸钠0.6g/L、二水合氯化钙1.8g/L、六水合氯化钴0.005g/L、pH7.0～7.2。
1.3 培养方法 挑取单菌落菌种孢子接种于种子培养基中，28℃培养48h，按5%的接种量接种于摇瓶培养基，28℃培养14d，放瓶测定。
1.4 阿维菌素标准曲线 准确称取阿维菌素标准品0.1g，以甲醇为溶剂配制成浓度为100μg/mL的母液，依次稀释获得浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL的阿维菌素溶液，在245nm处测得其吸光度OD值，反復实验3次取平均值。以阿维菌素浓度为横坐标，平均吸光度值为纵坐标，构建标准曲线。所绘标准曲线见图1。
1.5 单因素试验 在前期试验的基础上，其他条件保持不变，分别选择玉米淀粉浓度（10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L）、硫酸铵浓度（10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L）和丙酸钠浓度（0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L）3个因素进行单因素试验，考察各因素对阿维菌素浓度的影响。
1.6 响应面试验 根据单因素试验结果，采用3因素3水平Box-Behnken中心组合试验设计，考察玉米淀粉、硫酸铵及丙酸钠浓度对阿维菌素浓度的影响。
2 结果与分析
2.1 单因素试验对阿维菌素浓度的影响
2.1.1 玉米淀粉 由图2可知，随着玉米淀粉浓度的增加，阿维菌素浓度先增加后减少，在玉米淀粉浓度35g/L时，阿维菌素浓度达到最高。
2.1.2 硫酸铵 由图3可知，硫酸铵浓度在16g/L时，阿维菌素浓度达到最高。 2.1.3 丙酸钠 发酵过程中在培养基内加入一定浓度的前体物质丙酸钠，可显著提高发酵产量[8]。由图4可知，随着丙酸钠浓度的增加，阿维菌素浓度先增加后减少，在丙酸钠浓度为1.4g/L时，阿维菌素浓度达到最高。
2.2 Box-Behnken试验结果 根据单因素试验结果，以阿维菌素浓度（Y）为响应值，选取玉米淀粉浓度（A）、硫酸铵浓度（B）、丙酸钠浓度（C）3个因素进行了3因素3水平的Box-Behnken试验，响应面试验因素及水平表见表1，试验设计及结果见表2。
根据表2中试验结果，利用Design-Expert V8.06分析软件对表2试验结果进行二次回归分析，获得回归方程：
Y=4.45+0.14A+0.1B-0.11C+0.21AB+0.21AC-0.22BC-0.71A2-0.6B2-0.31C2
对二次多元回归模型进行方差分析，结果见表3。回归模型显著性检验和方差分析结果表明，模型P值<0.0001，拟合模型极显著，失拟项的P值为0.1119，大于0.05，差异不显著，说明此模型合理，拟合较好。该模型的相关系数和调整相关系数分别为R2=0.9823和R2Adj=0.9595，拟合模型能解释95.95%的响应值的改变。一次项A、B、C，交互项AB、AC、BC，二次项A2、B2、C2对结果影响显著（P<0.05）。
表3中F值反映各因素对阿维菌素浓度的影响强度，A>C>B，即玉米淀粉浓度>丙酸钠浓度>硫酸铵浓度。各因素交互作用响应面曲线图见图5～7。
通过Design-Expert V8.06软件分析得到最佳培养基组成如下：玉米淀粉浓度35.45g/L，硫酸铵浓度16.27g/L，丙酸钠浓度1.56g/L，阿维菌素浓度的理论预测值为4.477g/L。为了验证模型的准确性，采取优化后的培养基条件做验证试验，进行3次平行试验，得到阿维菌素浓度分别为4.502g/L、4.475g/L、4.498g/L，预测值与实测值较接近。说明用二次多项式数学模型进行优化符合设计目标，试验设计和数学模型具有可靠性和重现性。
3 结论
通过Box-Behnken响应面设计试验和分析，玉米淀粉浓度、硫酸铵浓度和丙酸钠浓度3个因素对阿维菌素浓度影响均显著;据此建立了影响阿维菌素浓度的二次多项回归方程模型，得到最佳培养基配方组成如下：玉米淀粉35.45g/L，硫酸铵16.27g/L，丙酸钠1.56g/L，在此条件下，阿维菌素浓度达4.492g/L。研究结果可对企业的实际生产提供理论依据。
参考文献
[1]李卫平.阿维菌素的研究进展[J].中国药业，2012，21（19）：108-110.
[2]李铭，冯伟，崔玉，等.阿维菌素类药物毒理学研究进展[J].安徽農学通报，2013，19（20）：29-32，39.
[3]陈振.阿维菌素衍生物设计、合成及杀虫活性研究[D].杭州：浙江农林大学，2016.
[4]何栋栋.阿维菌素高产菌株的诱变筛选及生产工艺的优化[D].天津：天津大学，2011.
[5]梁剑光，储消和，储炬，等.响应面法优化阿维菌素B1a生产菌株复合发酵培养基[J].中国医药工业杂志，2013，44（10）：986-988，1004.
[6]田萍萍，曹鹏，常传友，等.阿维菌素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及培养基优化[J].微生物学通报，2017，44（01）：150-160.
[7]胡栋，柯灵超，张敬宇，等.响应面法设计优化阿维菌素化学合成发酵培养基[J].中国抗生素杂志，2018，43（08）：1055-1061.
[8]李燕霞.阿维菌素产生菌培养条件的优化[J].河北化工，2009，32（03）：55-58.
（责编：张宏民）