【摘 要】
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目的探讨过表达内皮素-1(ET-1)对体外培养的大鼠肺细小动脉平滑肌细胞(RPMC)增殖/肥大的影响及其作用机制研究方法采用组织灌注法体外分离培养RPMC,脂质体介导法瞬时转染ET-1基因,经实时荧光定量逆转录-PCR和免疫印迹法鉴定后,用流式细胞技术检测细胞周期和细胞体积的变化,用免疫印迹法和细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,同时检测细胞总蛋白/总DNA比值的变化,并用免
【机 构】
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复旦大学附属中山医院麻醉科,上海,200032,复旦大学附属中山医院心内科,上海,200032,,
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目的探讨过表达内皮素-1(ET-1)对体外培养的大鼠肺细小动脉平滑肌细胞(RPMC)增殖/肥大的影响及其作用机制研究
方法采用组织灌注法体外分离培养RPMC,脂质体介导法瞬时转染ET-1基因,经实时荧光定量逆转录-PCR和免疫印迹法鉴定后,用流式细胞技术检测细胞周期和细胞体积的变化,用免疫印迹法和细胞免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,同时检测细胞总蛋白/总DNA比值的变化,并用免疫印迹法检测蛋白激酶B(Akt/PKB)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的磷酸化水平.采用SPSS 11.0统计软件处理数据,各组间比较均采用t检验
结果成功分离和培养RPMC并瞬时转染ET-1基因.与空载相比,转染48 h后RPMC细胞周期分布和细胞增殖指数未见明显差异,但转染72 h后检测到α-SMA合成功能增强,分别为空载转染组的1.3倍和1.2倍,细胞总蛋白/总DNA比也增高,分别为空载转染组的1.6倍和1.5倍.流式细胞术检测显示,与空载相比,转染72 h后RPMC细胞体积增大,分别为空载转染组的1.1倍和1.2倍.免疫印迹法检测显示,转染48 h后,Akt/PKB和mTOR的磷酸化水平升高,ERK1/2的磷酸化水平降低
结论过度表达ET-1可能经Akt/PKB-mTOR信号通路诱导RPMC肥大,在肺动脉高压的血管重塑过程中发挥重要作用.
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