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摘要
波斯菊是一种重要的观赏植物，叶枯病的发生影响其生长及市场价值。本文从陕西杨凌地区采集波斯菊病叶，通过保湿培养、单孢分离方法获得2株分离物。将分离菌的纯培养物接种健康寄主植物，发病后再分离的分离物与原接种病原菌菌株特征相同。采用形态学及rDNAITS、EF1α和GAPDH基因序列分析相结合的方法对分离菌进行鉴定，结果表明，两株菌株均为侵染向日葵链格孢Alternaria helianthiinficiens。这是国内外波斯菊上A.helianthiinficiens的首次报道。
关键词
侵染向日葵链格孢；波斯菊；叶枯病；形态学；多基因序列
中图分类号：
S 436.8
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.032
Isolation and identification of a new pathogen causing leafblight on Cosmos bipinnatus
Luo Huan，Jia Guogeng，Fan Xiaoyan，Liu Haifeng，Pei Dongfang，Deng Jianxin，Zhou Yi
（College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou434025， China）
Abstract
Cosmos bipinnatus is an important ornamental plant. The leaf blight disease can affect plant growth and market value. In this study， the causal agent was obtained from diseased leaves by single spore isolation and its pathogenicity was tested to fulfill the Koch’s rule. Based on the morphological characteristics and phylogenetic analysis of a combined gene sequence dataset （rDNAITS， EF1α and GAPDH）， the pathogen was identified as Alternaria helianthiinficiens. It’s the first report of leaf blight disease on C.bipinnatus caused by A.helianthiinficiens in the world.
Key words
Alternaria helianthiinficiens；Cosmos bipinnatus；leaf blight；morphology；sequence analysis
波斯菊Cosmos bipinnatus，一年生菊科秋英属观赏植物，原产于墨西哥和南美洲。因其花美叶茂、易栽培，被广泛应用于公园及道路等基础栽植区，环境效益优良[1]。波斯菊医药潜能巨大，既可作为传统中药材，治疗黄疸、间歇热、脾肿大等疾病，还可作为抗氧化剂，用于DNA氧化損伤治疗[2]。国内外研究发现，细菌[3]、植原体[4]、真菌[58]均可侵染波斯菊。
本文通过对波斯菊叶枯病病叶进行保湿培养，采用单孢分离法分离获得病原菌，依据柯赫氏法则验证其致病性，最后通过形态学与分子生物学相结合的方法进行种类鉴定，为波斯菊叶枯病的预测预报及防控提供理论依据。
1材料与方法
1.1病原菌的分离
2016年于陕西省西安市杨凌植物园采集波斯菊病叶，切取病健交界处，保湿培养后用无菌玻璃针进行单孢分离，将获得的纯培养物保存于PDA斜面及15%甘油中。
1.2致病性测定
将分离物的菌丝转接于V8培养基上，在22℃恒温条件下，每天光照8 h，培养7 d后，用无菌水洗脱分生孢子，过滤后离心，再用灭菌水将滤液配制成孢子悬浮液（105个/mL）。用无菌毛笔蘸取配制好的孢子悬浮液刷在健康的波斯菊叶片上，以无菌水作对照，室温培养于无菌保湿装置中，观察并记录发病情况。利用相同的方法对发病叶片中的病原菌进行再分离，并与原分离物进行对比，验证柯赫氏法则。重复3次。
1.3病原菌鉴定
选取分离的病原菌菌株YZU 161169及YZU 161170进行形态学与基因序列分析鉴定。
1.3.1形态学鉴定
菌落形态： 供试菌株在PDA培养基上培养2～3 d后用直径6 mm的无菌打孔器切取菌落边缘的菌丝块，转接于含PDA培养基的90 mm培养皿中央，25℃恒温黑暗培养7 d，观察菌落形态、分泌物颜色等，并测量菌落直径。
孢子形态： 挑取少量待试菌株菌丝转接于PCA（马铃薯20 g、胡萝卜20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）培养基上，在22℃恒温条件下，每天8 h光照，培养7 d后，观察并记录其分生孢子产孢方式、分生孢子与分生孢子梗的形态、颜色等，并随机测量50个成熟分生孢子的大小。
1.3.2多基因位点序列分析
将供试菌株在PDA培养基上培养5～7 d，刮取适量菌丝用液氮研磨后采取改良CTAB法提取DNA。PCR扩增和测序所用引物为ITS5和ITS4[9]、gpd1和gpd2[9]、EF446F和EF1473r[10]，均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。用体积为40 μL的2×Taq预混反应体系进行PCR扩增（Genstar，北京康润诚业生物科技有限公司）。获得的PCR产物在含核酸染料（GoldenView，北京博迈德基因技术有限公司）的1%琼脂凝胶上电泳后，在凝胶成像系统下成像，扩增产物由北京六合华大基因生物技术有限公司进行纯化，并利用正反引物测序。对获得的正反两个序列进行校正后，将完整的序列利用BLAST进行同源性比对分析，再利用Mega 7.0.26软件，将本研究序列与其他比对序列的3个基因序列拼接合并，最后利用RaxML软件构建ML（maximum likelihood）系统发育树，以自展法（bootstrap）进行检测，1 000次循环。 2结果与分析
2.1波斯菊叶枯病危害症状及致病性测定
波斯菊叶枯病6月初开始发病，受高温和多湿气候影响，7月中旬为发病高峰期。发病初期，病叶多见于植物中下部，受侵染叶片的叶尖部出现褐色坏死，靠近坏死部的叶组织常伴有褪绿现象（图1a），条件适宜时病害发展迅速，后期整个叶片黄萎枯死（图1b）。根据体视显微镜下观察到的分生孢子形态特征将所获得菌株初步判断为链格孢属真菌。将分离菌株的分生孢子接种于健康波斯菊叶片，接种24 h后叶片出现水渍状褐色斑点，2 d后接种叶片有明显坏死症状，3 d后整个叶尖大面积枯死（图1c），对照组未见发病症状。从接种后发病叶片上再分离的分离物与原接种病原菌菌株特征相同，表明所分离的链格孢是引起波斯菊叶枯病的病原菌。
2.2病原菌形态特征
选取的两株病原菌YZU 161169及YZU 161170的菌落形态及孢子形态一致。在PDA培养基上，25℃黑暗培养7 d后的菌落圆形，黄灰色，中央气生菌丝颜色稍浅、絮状，边缘呈绒毛状（图2a）。菌落背面中央浅棕色，有黄色色素产生、边缘呈淡黄色（图2b）。菌落大小为45～49 mm。
分离物在PCA培养基上的产孢表型如图3a所示，分生孢子单生或产生2个分生孢子的短链。分生孢子梗单生，直立或弯曲，黄褐色，具隔膜2～8个，大小为（54～130）μm×（4.8～6.5）μm。分生孢子倒棒状、长椭圆形或卵形，浅棕色至黄褐色，孢身具3～8个横隔膜，横隔膜间常有1～2个纵隔膜或斜隔膜，大小为（45～90）μm×（16～23.5）μm，无喙或有喙。喙圆柱状或丝状，常有1～3个隔膜，大小为（67～197）μm×（2.5～5.5）μm（图3b）。
通过形态学比较分析，发现菌株YZU 161169及YZU 161170的形态学特征与Alternaria helianthiinficiens一致[11]，形态学研究表明该病原菌为A.helianthiinficiens。
2.3病原菌分子生物学鉴定
将分离菌株YZU 161169和YZU 161170的rDNAITS、GAPDH、EF1α基因序列利用BLAST进行同源性比对分析，发现各序列与Alternaria helianthiinficiens的相似度均为100%，测序结果提交至GenBank获得的登录号见表1。将两株病原菌与其相近种的3个基因序列合并分析（共1197 bp），构建ML（maximum likelihood）系统发育树，结果显示该病原菌与Alternaria helianthiinficiens聚为一簇，bootstrap支持率为100%（图4）。表明波斯菊叶枯病的病原菌为A.helianthiinficiens。
3结论与讨论
本试验对波斯菊叶枯病病原菌进行了单孢分离、致病性测定、形态学鉴定，以及rDNAITS、GAPDH、EF1α基因序列分析，研究表明： 陕西杨凌波斯菊叶枯病的病原菌为链格孢属的Alternaria helianthiinficiens。Simmons[11]以Roberts从向日葵种子上分离的病原菌为模式菌株建立此種。Vrandecic等[12]首次报道其引起克罗地亚地区向日葵叶枯病及茎枯病，发病率10%～50%。孙霞[13]在我国新疆及云南两地的向日葵上首次报道此菌，并通过形态学鉴定确定其为侵染向日葵链格孢A.helianthiinficiens，并指出该种寄生性较强。本研究通过致病性试验发现，如果条件适宜，供试菌株可快速侵染波斯菊致其严重发病。此外，将供试菌株的菌丝块和孢子液接种离体向日葵、苦苣菜及飞蓬叶片，均可侵染导致发病。
波斯菊是优良的园林绿化材料，其种植面积不断扩大，而病害的发生极大地影响了其观赏价值。目前，国外已报道Alternaria cosmosa[5]，Cercospora fagopyri[6]，Colletotrichum acutatum[7]和Diaporthe stewartii[8]等病原真菌可侵染波斯菊引起病害，其中同为链格孢属的真菌A.cosmosa引起波斯菊叶枯病在症状上与A.helianthiinficiens并无明显差异。本研究首次发现并报道了波斯菊为Alternaria helianthiinficiens新寄主，为该菌引起的波斯菊叶枯病的防治提供了可靠依据。
参考文献
[1]Kiger R W. Cosmos Cavanilles [M]∥ Flora of North America Editorial Committee. Flora of North America North of Mexico. Volume 21： Magnoliophyta： Asteridae， part 8： Asteraceae， part 3. New YorkOxford： Oxford University Press， 2006： 203205.
[2]Jang I C， Park J H， Park E， et al. Antioxidative and antigenotoxic activity of extracts from cosmos （Cosmos bipinnatus） flowers[J].Plant Foods for Human Nutrition，2008，63：205210.
[3]Yugo K， Osamu N， Takamichi N， et al. First report of bacterial leaf blight on cosmos （Cosmos bipinnatus Cav.） caused by Pseudomonas cichorii in Japan[J]. Journal of General Plant Pahtology， 2014， 80： 499503. [4]Sawayanagi T， Jung H Y， Komatsu K， et al. Phytoplasma detected from yellow cosmos （Cosmos sulphureus） showing yellows symptoms （abstract in Japanese）[J]. Japanese Journal Phytopathology， 2002， 68： 258.
[5]Deng Jianxin， Lee J H， Paul N C， et al. Occurrence of leaf blight on cosmos caused by Alternaria cosmosa in Korea[J]. Plant Pathology Journal， 2015， 31（1）： 7882.
[6]Groenewald J Z， Nakashima C， Nishikawa J， et al. Species concepts in Cercospora： spotting the weeds among the roses[J]. Studies in Mycology， 2013， 75： 115170.
[7]Kwon J H， Kang S W， Son K E， et al. Anthracnose of cosmos caused by Colletotrichum acutatum in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 1999， 15： 172174.
[8]Udayanga D， Liu Xingzhong， Crous P W， et al. A multilocus phylogenetic evaluation of Diaporthe （Phomopsis）[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 157171.
[9]李河， 周國英， 徐建平. 一种新油茶炭疽病原多基因序列鉴定[J].植物保护，2015， 41（2）： 9296.
[10]宋博， 徐兵强， 朱晓锋， 等. 南疆红枣黑斑病病原鉴定及其保守基因序列分析[J]. 植物病理学报， 2017， 47（3）： 411415.
[11]Simmons E G. Alternaria： an identification manual [M]. CBS Fungal Biodiversity Centre Utrecht Press （Netherlands），2007.
[12]Vrandei K， Jurkovi D， osi J， et al. First report of foliar and stem blight on sunflower caused by Alternaria helianthiinficiens in Croatia [J]. Plant Disease， 2012， 96（11）： 1698.
[13]孙霞. 链格孢属真菌现代分类方法研究[D]. 泰安： 山东农业大学， 2006.
（责任编辑：杨明丽）
波斯菊是一种重要的观赏植物，叶枯病的发生影响其生长及市场价值。本文从陕西杨凌地区采集波斯菊病叶，通过保湿培养、单孢分离方法获得2株分离物。将分离菌的纯培养物接种健康寄主植物，发病后再分离的分离物与原接种病原菌菌株特征相同。采用形态学及rDNAITS、EF1α和GAPDH基因序列分析相结合的方法对分离菌进行鉴定，结果表明，两株菌株均为侵染向日葵链格孢Alternaria helianthiinficiens。这是国内外波斯菊上A.helianthiinficiens的首次报道。
关键词
侵染向日葵链格孢；波斯菊；叶枯病；形态学；多基因序列
中图分类号：
S 436.8
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.032
Isolation and identification of a new pathogen causing leafblight on Cosmos bipinnatus
Luo Huan，Jia Guogeng，Fan Xiaoyan，Liu Haifeng，Pei Dongfang，Deng Jianxin，Zhou Yi
（College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou434025， China）
Abstract
Cosmos bipinnatus is an important ornamental plant. The leaf blight disease can affect plant growth and market value. In this study， the causal agent was obtained from diseased leaves by single spore isolation and its pathogenicity was tested to fulfill the Koch’s rule. Based on the morphological characteristics and phylogenetic analysis of a combined gene sequence dataset （rDNAITS， EF1α and GAPDH）， the pathogen was identified as Alternaria helianthiinficiens. It’s the first report of leaf blight disease on C.bipinnatus caused by A.helianthiinficiens in the world.
Key words
Alternaria helianthiinficiens；Cosmos bipinnatus；leaf blight；morphology；sequence analysis
波斯菊Cosmos bipinnatus，一年生菊科秋英属观赏植物，原产于墨西哥和南美洲。因其花美叶茂、易栽培，被广泛应用于公园及道路等基础栽植区，环境效益优良[1]。波斯菊医药潜能巨大，既可作为传统中药材，治疗黄疸、间歇热、脾肿大等疾病，还可作为抗氧化剂，用于DNA氧化損伤治疗[2]。国内外研究发现，细菌[3]、植原体[4]、真菌[58]均可侵染波斯菊。
本文通过对波斯菊叶枯病病叶进行保湿培养，采用单孢分离法分离获得病原菌，依据柯赫氏法则验证其致病性，最后通过形态学与分子生物学相结合的方法进行种类鉴定，为波斯菊叶枯病的预测预报及防控提供理论依据。
1材料与方法
1.1病原菌的分离
2016年于陕西省西安市杨凌植物园采集波斯菊病叶，切取病健交界处，保湿培养后用无菌玻璃针进行单孢分离，将获得的纯培养物保存于PDA斜面及15%甘油中。
1.2致病性测定
将分离物的菌丝转接于V8培养基上，在22℃恒温条件下，每天光照8 h，培养7 d后，用无菌水洗脱分生孢子，过滤后离心，再用灭菌水将滤液配制成孢子悬浮液（105个/mL）。用无菌毛笔蘸取配制好的孢子悬浮液刷在健康的波斯菊叶片上，以无菌水作对照，室温培养于无菌保湿装置中，观察并记录发病情况。利用相同的方法对发病叶片中的病原菌进行再分离，并与原分离物进行对比，验证柯赫氏法则。重复3次。
1.3病原菌鉴定
选取分离的病原菌菌株YZU 161169及YZU 161170进行形态学与基因序列分析鉴定。
1.3.1形态学鉴定
菌落形态： 供试菌株在PDA培养基上培养2～3 d后用直径6 mm的无菌打孔器切取菌落边缘的菌丝块，转接于含PDA培养基的90 mm培养皿中央，25℃恒温黑暗培养7 d，观察菌落形态、分泌物颜色等，并测量菌落直径。
孢子形态： 挑取少量待试菌株菌丝转接于PCA（马铃薯20 g、胡萝卜20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL）培养基上，在22℃恒温条件下，每天8 h光照，培养7 d后，观察并记录其分生孢子产孢方式、分生孢子与分生孢子梗的形态、颜色等，并随机测量50个成熟分生孢子的大小。
1.3.2多基因位点序列分析
将供试菌株在PDA培养基上培养5～7 d，刮取适量菌丝用液氮研磨后采取改良CTAB法提取DNA。PCR扩增和测序所用引物为ITS5和ITS4[9]、gpd1和gpd2[9]、EF446F和EF1473r[10]，均由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。用体积为40 μL的2×Taq预混反应体系进行PCR扩增（Genstar，北京康润诚业生物科技有限公司）。获得的PCR产物在含核酸染料（GoldenView，北京博迈德基因技术有限公司）的1%琼脂凝胶上电泳后，在凝胶成像系统下成像，扩增产物由北京六合华大基因生物技术有限公司进行纯化，并利用正反引物测序。对获得的正反两个序列进行校正后，将完整的序列利用BLAST进行同源性比对分析，再利用Mega 7.0.26软件，将本研究序列与其他比对序列的3个基因序列拼接合并，最后利用RaxML软件构建ML（maximum likelihood）系统发育树，以自展法（bootstrap）进行检测，1 000次循环。 2结果与分析
2.1波斯菊叶枯病危害症状及致病性测定
波斯菊叶枯病6月初开始发病，受高温和多湿气候影响，7月中旬为发病高峰期。发病初期，病叶多见于植物中下部，受侵染叶片的叶尖部出现褐色坏死，靠近坏死部的叶组织常伴有褪绿现象（图1a），条件适宜时病害发展迅速，后期整个叶片黄萎枯死（图1b）。根据体视显微镜下观察到的分生孢子形态特征将所获得菌株初步判断为链格孢属真菌。将分离菌株的分生孢子接种于健康波斯菊叶片，接种24 h后叶片出现水渍状褐色斑点，2 d后接种叶片有明显坏死症状，3 d后整个叶尖大面积枯死（图1c），对照组未见发病症状。从接种后发病叶片上再分离的分离物与原接种病原菌菌株特征相同，表明所分离的链格孢是引起波斯菊叶枯病的病原菌。
2.2病原菌形态特征
选取的两株病原菌YZU 161169及YZU 161170的菌落形态及孢子形态一致。在PDA培养基上，25℃黑暗培养7 d后的菌落圆形，黄灰色，中央气生菌丝颜色稍浅、絮状，边缘呈绒毛状（图2a）。菌落背面中央浅棕色，有黄色色素产生、边缘呈淡黄色（图2b）。菌落大小为45～49 mm。
分离物在PCA培养基上的产孢表型如图3a所示，分生孢子单生或产生2个分生孢子的短链。分生孢子梗单生，直立或弯曲，黄褐色，具隔膜2～8个，大小为（54～130）μm×（4.8～6.5）μm。分生孢子倒棒状、长椭圆形或卵形，浅棕色至黄褐色，孢身具3～8个横隔膜，横隔膜间常有1～2个纵隔膜或斜隔膜，大小为（45～90）μm×（16～23.5）μm，无喙或有喙。喙圆柱状或丝状，常有1～3个隔膜，大小为（67～197）μm×（2.5～5.5）μm（图3b）。
通过形态学比较分析，发现菌株YZU 161169及YZU 161170的形态学特征与Alternaria helianthiinficiens一致[11]，形态学研究表明该病原菌为A.helianthiinficiens。
2.3病原菌分子生物学鉴定
将分离菌株YZU 161169和YZU 161170的rDNAITS、GAPDH、EF1α基因序列利用BLAST进行同源性比对分析，发现各序列与Alternaria helianthiinficiens的相似度均为100%，测序结果提交至GenBank获得的登录号见表1。将两株病原菌与其相近种的3个基因序列合并分析（共1197 bp），构建ML（maximum likelihood）系统发育树，结果显示该病原菌与Alternaria helianthiinficiens聚为一簇，bootstrap支持率为100%（图4）。表明波斯菊叶枯病的病原菌为A.helianthiinficiens。
3结论与讨论
本试验对波斯菊叶枯病病原菌进行了单孢分离、致病性测定、形态学鉴定，以及rDNAITS、GAPDH、EF1α基因序列分析，研究表明： 陕西杨凌波斯菊叶枯病的病原菌为链格孢属的Alternaria helianthiinficiens。Simmons[11]以Roberts从向日葵种子上分离的病原菌为模式菌株建立此種。Vrandecic等[12]首次报道其引起克罗地亚地区向日葵叶枯病及茎枯病，发病率10%～50%。孙霞[13]在我国新疆及云南两地的向日葵上首次报道此菌，并通过形态学鉴定确定其为侵染向日葵链格孢A.helianthiinficiens，并指出该种寄生性较强。本研究通过致病性试验发现，如果条件适宜，供试菌株可快速侵染波斯菊致其严重发病。此外，将供试菌株的菌丝块和孢子液接种离体向日葵、苦苣菜及飞蓬叶片，均可侵染导致发病。
波斯菊是优良的园林绿化材料，其种植面积不断扩大，而病害的发生极大地影响了其观赏价值。目前，国外已报道Alternaria cosmosa[5]，Cercospora fagopyri[6]，Colletotrichum acutatum[7]和Diaporthe stewartii[8]等病原真菌可侵染波斯菊引起病害，其中同为链格孢属的真菌A.cosmosa引起波斯菊叶枯病在症状上与A.helianthiinficiens并无明显差异。本研究首次发现并报道了波斯菊为Alternaria helianthiinficiens新寄主，为该菌引起的波斯菊叶枯病的防治提供了可靠依据。
参考文献
[1]Kiger R W. Cosmos Cavanilles [M]∥ Flora of North America Editorial Committee. Flora of North America North of Mexico. Volume 21： Magnoliophyta： Asteridae， part 8： Asteraceae， part 3. New YorkOxford： Oxford University Press， 2006： 203205.
[2]Jang I C， Park J H， Park E， et al. Antioxidative and antigenotoxic activity of extracts from cosmos （Cosmos bipinnatus） flowers[J].Plant Foods for Human Nutrition，2008，63：205210.
[3]Yugo K， Osamu N， Takamichi N， et al. First report of bacterial leaf blight on cosmos （Cosmos bipinnatus Cav.） caused by Pseudomonas cichorii in Japan[J]. Journal of General Plant Pahtology， 2014， 80： 499503. [4]Sawayanagi T， Jung H Y， Komatsu K， et al. Phytoplasma detected from yellow cosmos （Cosmos sulphureus） showing yellows symptoms （abstract in Japanese）[J]. Japanese Journal Phytopathology， 2002， 68： 258.
[5]Deng Jianxin， Lee J H， Paul N C， et al. Occurrence of leaf blight on cosmos caused by Alternaria cosmosa in Korea[J]. Plant Pathology Journal， 2015， 31（1）： 7882.
[6]Groenewald J Z， Nakashima C， Nishikawa J， et al. Species concepts in Cercospora： spotting the weeds among the roses[J]. Studies in Mycology， 2013， 75： 115170.
[7]Kwon J H， Kang S W， Son K E， et al. Anthracnose of cosmos caused by Colletotrichum acutatum in Korea [J]. Plant Pathology Journal， 1999， 15： 172174.
[8]Udayanga D， Liu Xingzhong， Crous P W， et al. A multilocus phylogenetic evaluation of Diaporthe （Phomopsis）[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 157171.
[9]李河， 周國英， 徐建平. 一种新油茶炭疽病原多基因序列鉴定[J].植物保护，2015， 41（2）： 9296.
[10]宋博， 徐兵强， 朱晓锋， 等. 南疆红枣黑斑病病原鉴定及其保守基因序列分析[J]. 植物病理学报， 2017， 47（3）： 411415.
[11]Simmons E G. Alternaria： an identification manual [M]. CBS Fungal Biodiversity Centre Utrecht Press （Netherlands），2007.
[12]Vrandei K， Jurkovi D， osi J， et al. First report of foliar and stem blight on sunflower caused by Alternaria helianthiinficiens in Croatia [J]. Plant Disease， 2012， 96（11）： 1698.
[13]孙霞. 链格孢属真菌现代分类方法研究[D]. 泰安： 山东农业大学， 2006.
（责任编辑：杨明丽）