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为建立一种快速、定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)时间分辨荧光免疫层析检测方法(TRFIA),本研究采用杂交瘤技术制备了抗PEDV N蛋白特异性单克隆抗体(MAb)5E6和1B7,将MAb 5E6与荧光微球偶联包被结合垫,将MAb 1B7和兔抗鼠IgG抗体分别包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线制备PEDV荧光微球免疫层析试纸条.优化了标记MAb 5E6、包被MAb 1B7的反应条件,并对其性能进行评价.结果显示,10μL 1％浓度的荧光微球标记MAb 5E6的量为18μg,MAb 1B7的包被浓度为1.2 mg/mL,最佳检测时间为点样后15 min;该方法与CSFV、PRRSV、TGEV、PDCoV及PRV Batha-K61株等均无交叉反应,特异性强;对PEDV的检测下限为389699.7 TCID50/0.1 mL,敏感性较高;对PEDV检测的线性范围为24940778.9 TCID50/0.1 mL～389699.7 TCID50/0.1 mL,线性范围较宽;批内和批间变异系数分别为8.76％、10.53％,重复性较好;试纸条在4℃和室温至少保存8个月,37℃则可保存10d,稳定性较好.该TRFIA试纸条与PEDV荧光定量PCR(FQ-PCR)平行检测160份疑似发病猪肛门拭子或小肠内容物样品.结果显示,该试纸条检测出76份阳性样品,84份阴性样品;FQ-PCR法检测出81份阳性样品,79份阴性样品,二者的总符合率为90.63％;经SPSS 22统计软件分析结果显示,K值为0.813,二者检测结果的一致性较高.本研究建立了一种简单、快速、灵敏和特异的基于MAb的TRFIA,为PEDV的现场检测提供了一种新方法.