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[摘要]目的 制备和鉴定抗人类肝癌细胞SMMC-7721的单克隆抗体。方法 采用高效免疫方法，利用人肝癌细胞系(SMMC-7721)作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过2次细胞融合、3次克隆化培养，制备新的杂交瘤细胞株，免疫印迹试验证明为特异性抗SMMC-7721的单克隆抗体。结果 本研究通过杂交瘤细胞融合技术，成功地制备了1株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结论 通过脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合，获取新的分泌抗人肝癌细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为肝癌的诊断及治疗奠定了基础。
[关键词]肝癌细胞 杂交瘤 单克隆抗体 免疫印迹
[中图分类号]R735.7
[文献标识码]A
[文章编号]1009—6019—(2010)—08—14—04
肝癌(liver cancer)是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，它发病率高，平均患病年龄为44岁，其恶性程度高且术后易复发。目前采用的手术、化疗、放疗三大常规治疗措施的效果均不理想，原因在于上述方法属减数性治疗，无法彻底清除残留细胞。开拓新的治疗途径势在必行，在免疫治疗中，肿瘤单抗和肿瘤疫苗是当今研究的热点，包括用肿瘤细胞免疫、输注淋巴细胞和非特异性的免疫刺激等。80年代早期开始，有人利用杂交瘤技术，将人脑胶质瘤培养细胞系LN-18和SHG-44作为抗原免疫小鼠，通过细胞融合，克隆化培养后获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。本研究的目的就是利用肝癌细胞系SMMC-7721免疫BALB/c小鼠，通过脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合，获取新的分泌抗人肝癌细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而为肝癌的诊断及治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 人肝癌细胞系(SMMC-7721)购于北京市肿瘤研究所；小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)购于中国军事科学研究院。
1.1.2 实验动物 BALB/c小鼠，雌性，鼠龄8周左右，体重18～20g，购于中国医科大学动物实验中心。
1.1.3 主要实验仪器 倒置显微镜(日本Nikon公司TE2000-U型)，光学/荧光显微镜(日本Nikon公司ACT-2U型)，CO2细胞培养箱(英国RS Biotech公司Galaxy S170型)，超净工作台(苏州安泰空气技术公司VS-1300L-U型)，UVIPRO凝胶图像获取及分析系统(英国Uvitec公司GAS70XX/71XX型，软件版本11.03)，纯水系统(德国SG公司Ultra ClearUV型)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SMMC-7721细胞为贴壁生长，所需培养液为含10％胎牛血清的1640培养液，待细胞长满培养瓶底80％时，加入0.05％胰蛋白酶消化后传代换液。SP2/0细胞呈轻度贴壁生长，所需培养液为含10％胎牛血清的1540培养液，待细胞长满培养瓶底80％后传代换液，不需加入胰蛋白酶。
1.2.2 实验动物的免疫 大量传代培养SMMC-7721细胞，收集并重悬于生理盐水中，计细胞总数为6×107，1000r/min，离心洗涤3次，每次8分钟，弃上清，然后将沉淀细胞溶于0.5mL盐水中，腹腔注射BALB/c小鼠，每周1次，共4次，最后1次为强化免疫，强化免疫后第3天取小鼠脾脏。
1.2.3 饲养细胞的制备 将BALB/c小鼠拉颈脱臼处死。剪开腹部皮肤，用无菌注射器吸取5mL生理盐水注入腹腔内，在腹腔内反复抽吸几次后吸出液体，注入离心管，1000r/min，离心10分钟，弃上清。将沉淀细胞重悬于含10％胎牛血清的1640培养液中，调整细胞浓度为2×105/mL，加入96孔培养板中，每孔0.1mL，置于37％、5％CO2的细胞培养箱内培养，以备细胞融合用。
1.2.4 免疫脾细胞悬液的制备 将已免疫的BALB/c小鼠摘除眼球放血，分离血清供抗体检测用。将小鼠处死并浸泡于75％乙醇中5分钟，然后于超净工作台内无菌取出脾脏，先用剪刀剪成小块，然后用注射器内芯挤压研磨，用GKN溶液冲洗制备成脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清，离心洗涤1次，然后将沉淀细胞重新悬浮于10mL1640培养液中，计数，共获得1×108个脾细胞，备用
1.2.5 细胞融合 分别吸取1×108个脾淋巴细胞和4×107个SP2/0细胞，加至50mL螺旋离心管中，离心弃上清。一手均匀转动离心管，另一手沿转动的管壁加入37℃预热的PEG溶液0.5mL，时间控制在60秒左右，然后加入20mL无血清培养液稀释，使PEG失去促融作用，800r/min，离心7分钟，弃上清。沉淀中加入30mL HAT培养液并轻轻吹打沉淀细胞，使其悬浮、混匀，将细胞悬液加人96孔培养板中，每孔0.1mL，然后将培养板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养。
1.2.6 杂交瘤细胞分泌抗体的ELISA检测 将SMMC-7721细胞裂解后所提取的蛋白质用包被缓冲液稀释至20μg/mL，包被于96孔酶标板上，4℃过夜，加入杂交瘤培养上清与SMMC-7721细胞抗原反应温育1小时，洗板后加入1：3000稀释的HRP酶标抗体温育1小时，加入底物和底物缓冲液各每孔50μL，室温5～20分钟，待显色满意后加入等体积2mol/L的硫酸终止反应，于酶标仪测定吸光度值[。
1.2.7 克隆化培养 用吸管吹打培养孔中经检测为抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，转种于24孔板，待细胞长满80％后，做ELISA检测，筛选出3个强阳性孔做克隆化培养，按照每孔分别含0.5个、1个和3个细胞各接种一块含饲养细胞的96孔板，然后置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，对阳性克隆孔继续进行2次有限稀释克隆化培养，直至第3次克隆化培养后，100％的克隆孔分泌特异性抗体。
1.2.8 免疫印迹 通过免疫印迹的方法验证所制备的单克隆抗体为特异性抗SMMC-7721的单克隆抗体。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞分泌抗体的检测 采用ELISA方法对细胞克隆孔进行抗体分泌检测，该法不受抗原、抗体浓度比例的影响，也不需浓缩待测样品，可直接测定。在86个样品检测孔中有24孔呈显色反应，测定各孔吸光度值。通过统计分析得出阳性率为27.9％。见图1。
2.2 杂交瘤细胞的克隆化培养 从阳性细胞克隆孔中挑选3个强阳性孔，采用有限稀释法进行单克隆化培养，3次克隆化培养的单克隆数。见表1。
2.3 克隆化培养后的细胞克隆抗体分泌的ELISA检测 第1次克隆化培养后，挑选出39个单克隆孔做ELISA检测，结果有22孔呈阳性显色反应，阳性率为56.4％。第2次克隆化培养后，挑选出28个单克隆孔做ELISA检测，结果有23个孔呈阳性显色反应，阳性率为82.1％。第3次克隆化培养后，挑选出30个单克隆孔做ELISA检测，结果有30个孔呈阳性显色反应，阳性率为100％。见图2。
2.4 免疫印迹 免疫印迹结果显示所制备的抗体为特异性抗SMMC-7721的单克隆抗体，见图3。
3 讨论
本次实验中采用了有限稀释法进行单克隆化，此方法是目前最常用的一种方法，广泛用于异质性细胞系的克隆化培养。它是采用梯度倍数稀释的原则，将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度，然后接种于微量培养板，培养一定时间后，微孔中可以出现单个细胞克隆。本法不需要特殊设备，操作简单，适合大量培养。克隆化时应反复吹打待克隆的杂交瘤细胞，尽量制备成单细胞悬液，便于准确计数，稀释步骤应做到准确，混合均匀，否则由于计数错误或稀释的误差很容易造成克隆化失败。
可供制备肿瘤单克隆抗体免疫用的抗原有很多种，其中传代培养的肿瘤细胞系和新鲜实体瘤细胞最为常用，选用新鲜的人肝癌实体瘤细胞，此种抗原新鲜而完整，能较好地反映人体原始肿瘤细胞所具有的一些基本特性，但其成分复杂，需经过一定的分离处理，而且筛选时工作量较大。癌细胞株经过长期传代培养，其抗原性和生物学行为都会发生变异，很难真正代表人体原始肿瘤细胞的表面结构和生物学特性及行为，但其作为抗原易于大量获得，成分单一、免疫和鉴定等方面比较简单。所以本次试验用人肝癌细胞系作为抗原制备相应的单克隆抗体有一定的优势。
本实验将肝癌细胞系SMMC-7721作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、HAT选择培养、克隆化培养、特异性抗体分泌的检测，免疫印迹等步骤，成功的制备了1株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这可能为肝癌的诊断及治疗发现新的制剂，并为基因工程抗体的研究奠定一定基础。
[关键词]肝癌细胞 杂交瘤 单克隆抗体 免疫印迹
[中图分类号]R735.7
[文献标识码]A
[文章编号]1009—6019—(2010)—08—14—04
肝癌(liver cancer)是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，它发病率高，平均患病年龄为44岁，其恶性程度高且术后易复发。目前采用的手术、化疗、放疗三大常规治疗措施的效果均不理想，原因在于上述方法属减数性治疗，无法彻底清除残留细胞。开拓新的治疗途径势在必行，在免疫治疗中，肿瘤单抗和肿瘤疫苗是当今研究的热点，包括用肿瘤细胞免疫、输注淋巴细胞和非特异性的免疫刺激等。80年代早期开始，有人利用杂交瘤技术，将人脑胶质瘤培养细胞系LN-18和SHG-44作为抗原免疫小鼠，通过细胞融合，克隆化培养后获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。本研究的目的就是利用肝癌细胞系SMMC-7721免疫BALB/c小鼠，通过脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合，获取新的分泌抗人肝癌细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株，进而为肝癌的诊断及治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 人肝癌细胞系(SMMC-7721)购于北京市肿瘤研究所；小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)购于中国军事科学研究院。
1.1.2 实验动物 BALB/c小鼠，雌性，鼠龄8周左右，体重18～20g，购于中国医科大学动物实验中心。
1.1.3 主要实验仪器 倒置显微镜(日本Nikon公司TE2000-U型)，光学/荧光显微镜(日本Nikon公司ACT-2U型)，CO2细胞培养箱(英国RS Biotech公司Galaxy S170型)，超净工作台(苏州安泰空气技术公司VS-1300L-U型)，UVIPRO凝胶图像获取及分析系统(英国Uvitec公司GAS70XX/71XX型，软件版本11.03)，纯水系统(德国SG公司Ultra ClearUV型)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SMMC-7721细胞为贴壁生长，所需培养液为含10％胎牛血清的1640培养液，待细胞长满培养瓶底80％时，加入0.05％胰蛋白酶消化后传代换液。SP2/0细胞呈轻度贴壁生长，所需培养液为含10％胎牛血清的1540培养液，待细胞长满培养瓶底80％后传代换液，不需加入胰蛋白酶。
1.2.2 实验动物的免疫 大量传代培养SMMC-7721细胞，收集并重悬于生理盐水中，计细胞总数为6×107，1000r/min，离心洗涤3次，每次8分钟，弃上清，然后将沉淀细胞溶于0.5mL盐水中，腹腔注射BALB/c小鼠，每周1次，共4次，最后1次为强化免疫，强化免疫后第3天取小鼠脾脏。
1.2.3 饲养细胞的制备 将BALB/c小鼠拉颈脱臼处死。剪开腹部皮肤，用无菌注射器吸取5mL生理盐水注入腹腔内，在腹腔内反复抽吸几次后吸出液体，注入离心管，1000r/min，离心10分钟，弃上清。将沉淀细胞重悬于含10％胎牛血清的1640培养液中，调整细胞浓度为2×105/mL，加入96孔培养板中，每孔0.1mL，置于37％、5％CO2的细胞培养箱内培养，以备细胞融合用。
1.2.4 免疫脾细胞悬液的制备 将已免疫的BALB/c小鼠摘除眼球放血，分离血清供抗体检测用。将小鼠处死并浸泡于75％乙醇中5分钟，然后于超净工作台内无菌取出脾脏，先用剪刀剪成小块，然后用注射器内芯挤压研磨，用GKN溶液冲洗制备成脾细胞悬液，1000r/min，离心5分钟，弃上清，离心洗涤1次，然后将沉淀细胞重新悬浮于10mL1640培养液中，计数，共获得1×108个脾细胞，备用
1.2.5 细胞融合 分别吸取1×108个脾淋巴细胞和4×107个SP2/0细胞，加至50mL螺旋离心管中，离心弃上清。一手均匀转动离心管，另一手沿转动的管壁加入37℃预热的PEG溶液0.5mL，时间控制在60秒左右，然后加入20mL无血清培养液稀释，使PEG失去促融作用，800r/min，离心7分钟，弃上清。沉淀中加入30mL HAT培养液并轻轻吹打沉淀细胞，使其悬浮、混匀，将细胞悬液加人96孔培养板中，每孔0.1mL，然后将培养板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养。
1.2.6 杂交瘤细胞分泌抗体的ELISA检测 将SMMC-7721细胞裂解后所提取的蛋白质用包被缓冲液稀释至20μg/mL，包被于96孔酶标板上，4℃过夜，加入杂交瘤培养上清与SMMC-7721细胞抗原反应温育1小时，洗板后加入1：3000稀释的HRP酶标抗体温育1小时，加入底物和底物缓冲液各每孔50μL，室温5～20分钟，待显色满意后加入等体积2mol/L的硫酸终止反应，于酶标仪测定吸光度值[。
1.2.7 克隆化培养 用吸管吹打培养孔中经检测为抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，转种于24孔板，待细胞长满80％后，做ELISA检测，筛选出3个强阳性孔做克隆化培养，按照每孔分别含0.5个、1个和3个细胞各接种一块含饲养细胞的96孔板，然后置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，对阳性克隆孔继续进行2次有限稀释克隆化培养，直至第3次克隆化培养后，100％的克隆孔分泌特异性抗体。
1.2.8 免疫印迹 通过免疫印迹的方法验证所制备的单克隆抗体为特异性抗SMMC-7721的单克隆抗体。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞分泌抗体的检测 采用ELISA方法对细胞克隆孔进行抗体分泌检测，该法不受抗原、抗体浓度比例的影响，也不需浓缩待测样品，可直接测定。在86个样品检测孔中有24孔呈显色反应，测定各孔吸光度值。通过统计分析得出阳性率为27.9％。见图1。
2.2 杂交瘤细胞的克隆化培养 从阳性细胞克隆孔中挑选3个强阳性孔，采用有限稀释法进行单克隆化培养，3次克隆化培养的单克隆数。见表1。
2.3 克隆化培养后的细胞克隆抗体分泌的ELISA检测 第1次克隆化培养后，挑选出39个单克隆孔做ELISA检测，结果有22孔呈阳性显色反应，阳性率为56.4％。第2次克隆化培养后，挑选出28个单克隆孔做ELISA检测，结果有23个孔呈阳性显色反应，阳性率为82.1％。第3次克隆化培养后，挑选出30个单克隆孔做ELISA检测，结果有30个孔呈阳性显色反应，阳性率为100％。见图2。
2.4 免疫印迹 免疫印迹结果显示所制备的抗体为特异性抗SMMC-7721的单克隆抗体，见图3。
3 讨论
本次实验中采用了有限稀释法进行单克隆化，此方法是目前最常用的一种方法，广泛用于异质性细胞系的克隆化培养。它是采用梯度倍数稀释的原则，将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度，然后接种于微量培养板，培养一定时间后，微孔中可以出现单个细胞克隆。本法不需要特殊设备，操作简单，适合大量培养。克隆化时应反复吹打待克隆的杂交瘤细胞，尽量制备成单细胞悬液，便于准确计数，稀释步骤应做到准确，混合均匀，否则由于计数错误或稀释的误差很容易造成克隆化失败。
可供制备肿瘤单克隆抗体免疫用的抗原有很多种，其中传代培养的肿瘤细胞系和新鲜实体瘤细胞最为常用，选用新鲜的人肝癌实体瘤细胞，此种抗原新鲜而完整，能较好地反映人体原始肿瘤细胞所具有的一些基本特性，但其成分复杂，需经过一定的分离处理，而且筛选时工作量较大。癌细胞株经过长期传代培养，其抗原性和生物学行为都会发生变异，很难真正代表人体原始肿瘤细胞的表面结构和生物学特性及行为，但其作为抗原易于大量获得，成分单一、免疫和鉴定等方面比较简单。所以本次试验用人肝癌细胞系作为抗原制备相应的单克隆抗体有一定的优势。
本实验将肝癌细胞系SMMC-7721作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、HAT选择培养、克隆化培养、特异性抗体分泌的检测，免疫印迹等步骤，成功的制备了1株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这可能为肝癌的诊断及治疗发现新的制剂，并为基因工程抗体的研究奠定一定基础。