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摘要：颗粒酶是细胞毒细胞发挥作用的效应蛋白之一。本文综述了颗粒酶的分子生物学特性，颗粒酶在ⅧV感染中的作用，及中医药的免疫调节对颗粒酶作用的研究进展。
关键词：颗粒酶；HIV感染；细胞毒细胞
中图分类号：R512.91 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）03-0089-02
在HIV感染中，由细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxie T Lym-phoeyte，CTL）和自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）介导的细胞毒性对于抑制HIV复制、延缓疾病进展发挥重要作用。颗粒酶是细胞毒性细胞所具有的重要效应分子之一，在病毒感染的病原清除和靶细胞凋亡中发挥重要的作用。本文将颗粒酶在HIV感染中的作用研究进展作一综述。
1颗粒酶的分子生物学特性
颗粒酶是存在于细胞毒性淋巴细胞胞浆颗粒的一组同源性的丝氨酸蛋白酶（serine protease），与穿孔素（pore-formingprotein，PFP）一起储存于胞浆颗粒中，并一起通过胞吐作用释放至靶细胞间隙，协同作用致靶细胞损伤。人颗粒酶包括颗粒酶A、B、K、H等，与疾病相关的免疫效应关系较密切的是颗粒酶A（granzyme A，GzmA）、颗粒酶B（gaanzyme B，GzmB），尤以GzmB为最多见且极具价值。
人的GzmA基因定位于5号染色体上，GzmA分子是Ha-nuka因子cDNA编码产物，由两个分子量为27KD的单体通过二硫化合物连接成50KD的同源二聚体，具有类胰蛋白酶的性质，在体内能缓慢引起靶细胞DNA断裂。人的GzmB基因定位于14号染色体上，GzmB是人类淋巴细胞蛋白酶（HLP）cD-NA编码的产物，分子量有30KD、32KD、35KD 3种形式，经葡萄糖苷酶水解后均剩下一个27KD的蛋白核心，说明3种形式的GzmB是同一蛋白带有不同的糖基。GzmB具有门冬氨酸酶的活性，是主要效应分子，能迅速引起靶DNA断裂，作用强于GzmA。
活化的CTL和NK细胞是机体细胞毒细胞，能清除机体内的病毒感染细胞、胞内菌、肿瘤细胞并介导移植排斥反应、自身免疫病和移植物抗宿主病。颗粒酶是活化的CTL和NK细胞的效应分子，主要介导细胞凋亡。GzmA、GzmB含量最丰富，表达上亦早于其它颗粒酶。GzmA主要诱导一种easpases非依赖性的细胞凋亡，它通过颗粒的胞吐作用释放，在PFP协同作用下进入靶细胞的细胞浆中，并聚集在细胞核，通过裂解SET复合物释放的脱氧核糖核酸酶NM23-H1对染色体DNA形成单股DNA链切（缺）口而引起DNA断裂，最终引起靶细胞的凋亡。GzmB最初以酶原的形式合成，在内质网中加工去除N端信号肽后，贮存于CTL的颗粒中。当CTL识别靶细胞时，GzmB N端的酸性二肽被切除，成为活性形式。活性型GzmB可通过穿孔素或受体进入靶细胞，切割含Asp-X，Glu-X位点的多种结构和功能蛋白，引起细胞凋亡。
2颗粒酶在HIV感染中的作用
人体感染了HIV后很快建立了特异性的细胞免疫反应和体液免疫反应以清除病毒。特异性的中和抗体可以迅速中和细胞外病毒，阻止其侵入易感细胞及在体内扩散，但无法杀死细胞内病毒，细胞介导的免疫反应可通过溶解病毒感染细胞或分泌抗病毒因子杀灭细胞内病毒。因此，细胞免疫反应在人体抵御病毒感染中起着中心和基础的作用。细胞免疫反应主要包括由NK细胞介导的天然免疫反应和由CD8+的CTL介导的获得性免疫反应，二者构成了机体防御病毒感染和转化细胞的主要机制。
在HIV感染中，由CTL和NK细胞介导的细胞毒性对于抑制HIV复制、延缓疾病进展发挥着重要作用，HIV特异性CTL在特异性抗体产生前即能检测到，能有效降低病毒载量，早期CTL反应的强弱直接影响HIV感染后进展为艾滋病的时间；NK细胞是机体抵御HIV和机会性感染的第一道防线。文献报道，CTL和NK细胞数量异常存在于艾滋病疾病进程的不同阶段，但其功能损伤机制及评价指标尚无定论。CTL和NK细胞对HIV的控制都主要通过颗粒胞吐途径溶解病毒感染细胞，颗粒酶是这一机制中重要的效应分子之一。
颗粒酶的释放是CTL特异杀伤的基础，活化的CTL通过特异识别靶细胞，含有颗粒酶的胞浆分泌颗粒在CTL内重新定位于靶细胞接触的细胞膜位点，然后将颗粒酶和穿孔素分泌到细胞间隙。细胞毒细胞的活化过程伴随有颗粒酶的合成产生过程，CTL识别靶细胞后，一方面以细胞排粒的方式分泌颗粒酶，一方面又迅速合成颗粒酶，新合成的颗粒酶既能直接持续分泌到细胞外，又能“再充入”胞浆颗粒中贮存起来，以供杀伤下一个靶细胞。
HIV特异性CD8+T淋巴细胞能控制HIV的复制，延缓疾病进程，这与HIV特异性CD8+T淋巴细胞利用PEP和GzmB或CD95L直接杀伤被HIV-1感染的细胞，从而清除感染原密切相关。北京协和医院李太生教授等研究发现，CD8+T淋巴细胞在对HIV病毒的控制中不能单纯起作用，而是受抗HIV特异性CD4+T淋巴细胞应答的指挥。麻省普科医院理根研究所和哈佛大学的研究人员发现HIV特异性CD4+T淋巴细胞应答具有细胞杀伤活性，可破坏HIV感染的巨噬细胞，而CD4+T淋巴细胞应答受到GzmA表达的支配。HIV特异性CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴細胞发挥其抗HIV生物活性与GzmA、GzmB有关。 NK細胞的主要功能就是通过多种机制溶解杀伤靶细胞。GzmB是NK细胞释放的胞浆颗粒，可以与PEP配合溶解靶细胞或介导靶细胞凋亡。周方圆等用流式细胞仪检测了未经HAART治疗的CD4+T细胞高和低两组HIV感染者外周血NK细胞及各亚群IFN-γ、CD107a和GzmB的表达情况，结果CD4+T细胞高组NK细胞及各亚群分泌IFN-γ和CD107a的水平较HIV抗体阴性对照组高，GzmB释放百分比高于HIV抗体阴性对照组和CD4+T细胞低组，其IFN-γ+NK细胞百分比与病毒载量呈显著负相关。提示NK细胞功能增强可能是控制HIV感染疾病进程的因素之一。
3中医药的免疫调节对颗粒酶的作用
临床观察表明中医药可调节艾滋病患者的免疫功能，改善患者的临床症状，提高患者的生存质量。对其免疫调节作用进一步研究发现：中医药治疗可明显增强艾滋病患者HIV特异性T细胞免疫应答强度，这可能是中药治疗艾滋病调节免疫作用机制之一。但目前中医药增强HIV特异性T细胞免疫应答是否与GzmA、GzmB相关国内无报道。李曼等用由女贞子，早莲草等组成的补肾方治疗慢性乙型肝炎，患者经补肾方治疗6个月后，其CD8+T细胞表达的GzmB降低，提示中医药可减少T细胞免疫效应分子的表达。钱洁玉等探讨了益艾康含药血清对人自然杀伤细胞增殖及其效应分子颗粒酶基因表达的影响，不同浓度的益艾康含药血清均能够促进NK-92MI细胞增殖，增强NK-92MI细胞毒功能，其机制可能与上调颗粒酶基因的表达有关。李晓楠等观察了中药黄芩的主要活性成分汉黄芩素对人外周血单个核细胞CD3AK细胞增殖及对肝癌细胞SMMC-7721杀伤活性的影响，结果汉黄芩素在一定浓度范围内能够促进CD3AK细胞增殖，增强其对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性，抑制SMMC-7721细胞生长、迁移和细胞的融合。汉黄芩素促进CD3AK细胞增殖和功能改变可能与上调CD3AK细胞表面GzmB的表达有关。上述这些研究报道提示中医药的免疫调节作用与颗粒酶有关。
4小结
免疫系统是一个复杂的网络，任何环节都是相关联的，在HIV感染的情况下，其复杂性更加难以想象，正是这种复杂的网络型结构，为中药抗HIV/AIDS的研究提供了可能。阐明中医药对HIV感染者机体免疫调节作用是中医药治疗艾滋病的临床应用所需，而目前安全、科学、规范地开展中医药治疗艾滋病改善机体免疫作用机制方面研究仍存在较大的困难。研究中医药治疗的艾滋病患者其外周血中颗粒酶变化情况，不失为一种探索中医药调节免疫在艾滋病治疗中作用的方法，值得在临床中进一步探索研究。
（收稿日期：2016-11-15）
关键词：颗粒酶；HIV感染；细胞毒细胞
中图分类号：R512.91 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）03-0089-02
在HIV感染中，由细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxie T Lym-phoeyte，CTL）和自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）介导的细胞毒性对于抑制HIV复制、延缓疾病进展发挥重要作用。颗粒酶是细胞毒性细胞所具有的重要效应分子之一，在病毒感染的病原清除和靶细胞凋亡中发挥重要的作用。本文将颗粒酶在HIV感染中的作用研究进展作一综述。
1颗粒酶的分子生物学特性
颗粒酶是存在于细胞毒性淋巴细胞胞浆颗粒的一组同源性的丝氨酸蛋白酶（serine protease），与穿孔素（pore-formingprotein，PFP）一起储存于胞浆颗粒中，并一起通过胞吐作用释放至靶细胞间隙，协同作用致靶细胞损伤。人颗粒酶包括颗粒酶A、B、K、H等，与疾病相关的免疫效应关系较密切的是颗粒酶A（granzyme A，GzmA）、颗粒酶B（gaanzyme B，GzmB），尤以GzmB为最多见且极具价值。
人的GzmA基因定位于5号染色体上，GzmA分子是Ha-nuka因子cDNA编码产物，由两个分子量为27KD的单体通过二硫化合物连接成50KD的同源二聚体，具有类胰蛋白酶的性质，在体内能缓慢引起靶细胞DNA断裂。人的GzmB基因定位于14号染色体上，GzmB是人类淋巴细胞蛋白酶（HLP）cD-NA编码的产物，分子量有30KD、32KD、35KD 3种形式，经葡萄糖苷酶水解后均剩下一个27KD的蛋白核心，说明3种形式的GzmB是同一蛋白带有不同的糖基。GzmB具有门冬氨酸酶的活性，是主要效应分子，能迅速引起靶DNA断裂，作用强于GzmA。
活化的CTL和NK细胞是机体细胞毒细胞，能清除机体内的病毒感染细胞、胞内菌、肿瘤细胞并介导移植排斥反应、自身免疫病和移植物抗宿主病。颗粒酶是活化的CTL和NK细胞的效应分子，主要介导细胞凋亡。GzmA、GzmB含量最丰富，表达上亦早于其它颗粒酶。GzmA主要诱导一种easpases非依赖性的细胞凋亡，它通过颗粒的胞吐作用释放，在PFP协同作用下进入靶细胞的细胞浆中，并聚集在细胞核，通过裂解SET复合物释放的脱氧核糖核酸酶NM23-H1对染色体DNA形成单股DNA链切（缺）口而引起DNA断裂，最终引起靶细胞的凋亡。GzmB最初以酶原的形式合成，在内质网中加工去除N端信号肽后，贮存于CTL的颗粒中。当CTL识别靶细胞时，GzmB N端的酸性二肽被切除，成为活性形式。活性型GzmB可通过穿孔素或受体进入靶细胞，切割含Asp-X，Glu-X位点的多种结构和功能蛋白，引起细胞凋亡。
2颗粒酶在HIV感染中的作用
人体感染了HIV后很快建立了特异性的细胞免疫反应和体液免疫反应以清除病毒。特异性的中和抗体可以迅速中和细胞外病毒，阻止其侵入易感细胞及在体内扩散，但无法杀死细胞内病毒，细胞介导的免疫反应可通过溶解病毒感染细胞或分泌抗病毒因子杀灭细胞内病毒。因此，细胞免疫反应在人体抵御病毒感染中起着中心和基础的作用。细胞免疫反应主要包括由NK细胞介导的天然免疫反应和由CD8+的CTL介导的获得性免疫反应，二者构成了机体防御病毒感染和转化细胞的主要机制。
在HIV感染中，由CTL和NK细胞介导的细胞毒性对于抑制HIV复制、延缓疾病进展发挥着重要作用，HIV特异性CTL在特异性抗体产生前即能检测到，能有效降低病毒载量，早期CTL反应的强弱直接影响HIV感染后进展为艾滋病的时间；NK细胞是机体抵御HIV和机会性感染的第一道防线。文献报道，CTL和NK细胞数量异常存在于艾滋病疾病进程的不同阶段，但其功能损伤机制及评价指标尚无定论。CTL和NK细胞对HIV的控制都主要通过颗粒胞吐途径溶解病毒感染细胞，颗粒酶是这一机制中重要的效应分子之一。
颗粒酶的释放是CTL特异杀伤的基础，活化的CTL通过特异识别靶细胞，含有颗粒酶的胞浆分泌颗粒在CTL内重新定位于靶细胞接触的细胞膜位点，然后将颗粒酶和穿孔素分泌到细胞间隙。细胞毒细胞的活化过程伴随有颗粒酶的合成产生过程，CTL识别靶细胞后，一方面以细胞排粒的方式分泌颗粒酶，一方面又迅速合成颗粒酶，新合成的颗粒酶既能直接持续分泌到细胞外，又能“再充入”胞浆颗粒中贮存起来，以供杀伤下一个靶细胞。
HIV特异性CD8+T淋巴细胞能控制HIV的复制，延缓疾病进程，这与HIV特异性CD8+T淋巴细胞利用PEP和GzmB或CD95L直接杀伤被HIV-1感染的细胞，从而清除感染原密切相关。北京协和医院李太生教授等研究发现，CD8+T淋巴细胞在对HIV病毒的控制中不能单纯起作用，而是受抗HIV特异性CD4+T淋巴细胞应答的指挥。麻省普科医院理根研究所和哈佛大学的研究人员发现HIV特异性CD4+T淋巴细胞应答具有细胞杀伤活性，可破坏HIV感染的巨噬细胞，而CD4+T淋巴细胞应答受到GzmA表达的支配。HIV特异性CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴細胞发挥其抗HIV生物活性与GzmA、GzmB有关。 NK細胞的主要功能就是通过多种机制溶解杀伤靶细胞。GzmB是NK细胞释放的胞浆颗粒，可以与PEP配合溶解靶细胞或介导靶细胞凋亡。周方圆等用流式细胞仪检测了未经HAART治疗的CD4+T细胞高和低两组HIV感染者外周血NK细胞及各亚群IFN-γ、CD107a和GzmB的表达情况，结果CD4+T细胞高组NK细胞及各亚群分泌IFN-γ和CD107a的水平较HIV抗体阴性对照组高，GzmB释放百分比高于HIV抗体阴性对照组和CD4+T细胞低组，其IFN-γ+NK细胞百分比与病毒载量呈显著负相关。提示NK细胞功能增强可能是控制HIV感染疾病进程的因素之一。
3中医药的免疫调节对颗粒酶的作用
临床观察表明中医药可调节艾滋病患者的免疫功能，改善患者的临床症状，提高患者的生存质量。对其免疫调节作用进一步研究发现：中医药治疗可明显增强艾滋病患者HIV特异性T细胞免疫应答强度，这可能是中药治疗艾滋病调节免疫作用机制之一。但目前中医药增强HIV特异性T细胞免疫应答是否与GzmA、GzmB相关国内无报道。李曼等用由女贞子，早莲草等组成的补肾方治疗慢性乙型肝炎，患者经补肾方治疗6个月后，其CD8+T细胞表达的GzmB降低，提示中医药可减少T细胞免疫效应分子的表达。钱洁玉等探讨了益艾康含药血清对人自然杀伤细胞增殖及其效应分子颗粒酶基因表达的影响，不同浓度的益艾康含药血清均能够促进NK-92MI细胞增殖，增强NK-92MI细胞毒功能，其机制可能与上调颗粒酶基因的表达有关。李晓楠等观察了中药黄芩的主要活性成分汉黄芩素对人外周血单个核细胞CD3AK细胞增殖及对肝癌细胞SMMC-7721杀伤活性的影响，结果汉黄芩素在一定浓度范围内能够促进CD3AK细胞增殖，增强其对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性，抑制SMMC-7721细胞生长、迁移和细胞的融合。汉黄芩素促进CD3AK细胞增殖和功能改变可能与上调CD3AK细胞表面GzmB的表达有关。上述这些研究报道提示中医药的免疫调节作用与颗粒酶有关。
4小结
免疫系统是一个复杂的网络，任何环节都是相关联的，在HIV感染的情况下，其复杂性更加难以想象，正是这种复杂的网络型结构，为中药抗HIV/AIDS的研究提供了可能。阐明中医药对HIV感染者机体免疫调节作用是中医药治疗艾滋病的临床应用所需，而目前安全、科学、规范地开展中医药治疗艾滋病改善机体免疫作用机制方面研究仍存在较大的困难。研究中医药治疗的艾滋病患者其外周血中颗粒酶变化情况，不失为一种探索中医药调节免疫在艾滋病治疗中作用的方法，值得在临床中进一步探索研究。
（收稿日期：2016-11-15）