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摘要 对金龟子绿僵菌30103菌株在不同浓度吐温80、不同维生素液体培养基中进行液体深层培养研究，结果表明：不同浓度吐温80对液生分生孢子的产量影响显著，培养基中吐温80含量在0.6%～1.0%时，可获最大产孢量；不同维生素对生物量和液生分生孢子的产量影响显著，在培养基中添加适宜维生素能有效刺激液生分生孢子的形成，复合维生素、B2B1B6、B6B1H能使绿僵菌获得较高的液生分生孢子产量。
关键词 金龟子绿僵菌；液生芽孢子；液生分生孢子；生物量
中图分类号 S476.12 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0088-02
绿僵菌在液体深层培养中某些菌株能以微循环产孢方式，即不经营养生长阶段，直接从液生芽孢子上形成液生分生孢子[1-2]。这种产孢现象的发生与培养液的成分和条件密切相关，该文研究在液体培养基中不同浓度吐温80、不同维生素影响绿僵菌的微循环产孢进程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株。金龟子绿缰菌（Metarrhizzium anisopliae）30103。
1.1.2 培养液成分。①不同培养时间的培养液成分。碳素：蔗糖（25 g/L），氮源：花生饼粉（15 g/L），基础盐：KH2PO4（1.5 g/L）、MgSO4·7H2O（0.5 g/L）、CaCl2（0.01 g/L），微量元素：H3BO3（0.03 mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.05 mg/L）、CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）、FeCl3·6H2O（0.5 mg/L），维生素：B1（15 μg/g）、B6（100 μg/g）、H（15 μg/g），pH值6.5，吐温80浓度0.6%。②不同浓度吐温培养液成分。碳素：蔗糖（25 g/L），氮源：花生饼粉（15 g/L），基础盐：KH2PO4（1.5 g/L）、MgSO4·7H2O（0.5 g/L）、CaCl2（0.01 g/L），微量元素：H3BO3（0.03 mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.05 mg/L）、CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）、FeCl3·6H2O（0.5 mg/L），维生素：B1（15μg/g）、B6（100 μg/g）、H（15 μg/g），pH值6.5，吐温80浓度：0、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%、1.40%。③不同维生素培养液成分。碳素：蔗糖（25 g/L），氮源：花生饼粉（15 g/L），基础盐：KH2PO4（1.5 mg/L）、MgSO4·7H2O（0.5 mg/L）、CaCl2（0.01 mg/L），微量元素：H3BO3（0.03 mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.05 mg/L）、CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）、FeCl3·6H2O（0.5 mg/L），维生素：B1（15 μg/g）、B6（100 μg/g）、H（15 μg/g），pH值6.5，吐温80浓度0.6%。维生素（15 μg/g）：B1、B2、B6、C、H、B4、右旋泛酸钙、复合维生素、B2B1、B2B6、B6B4、B6右旋泛酸钙、B2B1C、B1B2B6、B2CH、B2B4右旋泛酸钙、B6B1C、B6B1H、B6CH、B6B4右旋泛酸钙、B2C、B2H、B6B1、B6H。
1.2 接种培养
1.2.1 接种悬浮液制备。取供试斜面菌种分别加入含0.05%吐温80无菌水，用无菌操作的方法打散混匀，稀释并用血球计数板准确测定其含孢量达1×106个/mL，用250 mL的三角烧瓶装入49 mL培养液灭菌，接入1 mL孢子悬浮液，接种量为1×106个，设3次重复，恒温摇床培养，温度为（25±1）℃，振荡频率130 r/min[3-4]。
1.2.2 观察测定。接种后每隔12 h用无菌吸管取样观察生长情况，有液生孢子出现且用血球计数板计数时进行计数（个/mL），生物量用于物质称量法测定（培养液过滤，120 ℃烘箱烘干2 h后称重）[5-6]。
2 结果与分析
2.1 液体产物形成过程和形态
振荡培养24 h，孢子开始萌发，原生质转移到芽管生长点，芽管自孢子一端或二端或四周均有伸出。48 h菌体呈网状，形成黄色菌团或散生。60 h菌体出现产孢结构，开始形成液生芽孢子，芽孢子呈长卵形。72 h后芽孢子大量形成，部分芽孢子以微循环产孢方式，直接从芽孢子上形成分生孢子，液生分生孢子卵球形，与气生分生孢子有明显差异，此后液生分生孢子产量逐渐增加，120～144 h达到最高产量。
2.2 不同浓度吐温80对生物量、液生孢子形成的影响
表2为不同浓度吐温80培养液振荡培养144 h后生物量及液生分生孢子产孢情况。经方差分析可知，吐温80对生物量影响不显著，F=0.54F0.01（9，20）=3.46。吐温80对液生分生孢子的产量影响极显著，F=6.28>F0.01（9，20）=3.46，培养基中吐温含量在0.6%～1.0%时，有利于绿僵菌液生分生孢子的形成。
2.3 不同维生素对生物量、液生孢子形成的影响
表3为不同维生素培养液振荡培养144 h后生物量及液生分生孢子产孢情况。经方差分析可知，不同维生素对生物量影响极显著，F=5.45>F0.01（24，50）=2.18。不同维生素对液生芽孢子的形成影响达极显著水平，F=28.39>F0.01（24，50）=2.18。不同维生素对液生分生孢子的产量影响极显著，F=12.46>F0.01（9，20）=2.18。不同维生素对生物量、液生芽孢子、液生分生孢子的产量影响极显著，生长良好状况有复合维生素、B2B1B6、B6B1H等。复杂的维生素组合比单一的维生素液分生孢子的产量高，未添加维生素的对照组产孢量最低。
3 结论与讨论
不同浓度吐温80对绿僵菌液生分生孢子的产量影响差异极显著，培养基中吐温80含量在0.6%～1.0%，可获最大产孢量。适宜吐温含量，培养液的黏稠度适中，菌体不易徒长，与此同时又形成发育良好的菌丝团，产孢结构发育充分，产孢点多，产孢量大。
不同维生素对绿僵菌生物量、液生分生孢子的产量影响差异极显著，生长良好状况有复合维生素、B2B1B6、B6B1H等。可见，培养液中添加适宜的维生素作为生长辅助因子，能有效促进生物量、液生芽孢子和液生分生孢子的产量，从而构成一条良好的产孢路线，为进一步研究液体深层发酵产生绿僵菌分生孢子提供参考价值。
4 参考文献
[1] 樊美珍，郭超，薛文奇，等.金龟子绿缰菌液体深层培养初探[J].中国虫草真菌研究与应用，1993（3）：146-149.
[2] 宋漳.九株绿僵菌液体振荡培养初步研究[J].福建林学院报，1996，16（1）：38-40.
[3] VEZINA C，SINGMH K，SEHGALS N.Sporulation of filamentous fungi in submerged culture[J].Mycologia，1965，57（5）：722-736.
[4] 叶小真，陈全助，宋漳.10种化学杀虫剂对金龟子绿僵菌生物学性状的影响[J].福建林学院学报，2012，32（2）：169-173.
[5] 王丹琪，叶素丹，陈春.新型旋风分离器高效分离多株生防真菌分生孢子[J].中国生物防治学报，2013（1）：61-67.
[6] 宋漳，叶小真，叶斌.液固两相法培养金龟子绿僵菌的研究[J].福建林学院学报，2012，32（2）：163-168.
关键词 金龟子绿僵菌；液生芽孢子；液生分生孢子；生物量
中图分类号 S476.12 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）08-0088-02
绿僵菌在液体深层培养中某些菌株能以微循环产孢方式，即不经营养生长阶段，直接从液生芽孢子上形成液生分生孢子[1-2]。这种产孢现象的发生与培养液的成分和条件密切相关，该文研究在液体培养基中不同浓度吐温80、不同维生素影响绿僵菌的微循环产孢进程。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株。金龟子绿缰菌（Metarrhizzium anisopliae）30103。
1.1.2 培养液成分。①不同培养时间的培养液成分。碳素：蔗糖（25 g/L），氮源：花生饼粉（15 g/L），基础盐：KH2PO4（1.5 g/L）、MgSO4·7H2O（0.5 g/L）、CaCl2（0.01 g/L），微量元素：H3BO3（0.03 mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.05 mg/L）、CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）、FeCl3·6H2O（0.5 mg/L），维生素：B1（15 μg/g）、B6（100 μg/g）、H（15 μg/g），pH值6.5，吐温80浓度0.6%。②不同浓度吐温培养液成分。碳素：蔗糖（25 g/L），氮源：花生饼粉（15 g/L），基础盐：KH2PO4（1.5 g/L）、MgSO4·7H2O（0.5 g/L）、CaCl2（0.01 g/L），微量元素：H3BO3（0.03 mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.05 mg/L）、CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）、FeCl3·6H2O（0.5 mg/L），维生素：B1（15μg/g）、B6（100 μg/g）、H（15 μg/g），pH值6.5，吐温80浓度：0、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%、1.40%。③不同维生素培养液成分。碳素：蔗糖（25 g/L），氮源：花生饼粉（15 g/L），基础盐：KH2PO4（1.5 mg/L）、MgSO4·7H2O（0.5 mg/L）、CaCl2（0.01 mg/L），微量元素：H3BO3（0.03 mg/L）、Na2MoO4·2H2O（0.05 mg/L）、CuSO4·5H2O（0.08 mg/L）、FeCl3·6H2O（0.5 mg/L），维生素：B1（15 μg/g）、B6（100 μg/g）、H（15 μg/g），pH值6.5，吐温80浓度0.6%。维生素（15 μg/g）：B1、B2、B6、C、H、B4、右旋泛酸钙、复合维生素、B2B1、B2B6、B6B4、B6右旋泛酸钙、B2B1C、B1B2B6、B2CH、B2B4右旋泛酸钙、B6B1C、B6B1H、B6CH、B6B4右旋泛酸钙、B2C、B2H、B6B1、B6H。
1.2 接种培养
1.2.1 接种悬浮液制备。取供试斜面菌种分别加入含0.05%吐温80无菌水，用无菌操作的方法打散混匀，稀释并用血球计数板准确测定其含孢量达1×106个/mL，用250 mL的三角烧瓶装入49 mL培养液灭菌，接入1 mL孢子悬浮液，接种量为1×106个，设3次重复，恒温摇床培养，温度为（25±1）℃，振荡频率130 r/min[3-4]。
1.2.2 观察测定。接种后每隔12 h用无菌吸管取样观察生长情况，有液生孢子出现且用血球计数板计数时进行计数（个/mL），生物量用于物质称量法测定（培养液过滤，120 ℃烘箱烘干2 h后称重）[5-6]。
2 结果与分析
2.1 液体产物形成过程和形态
振荡培养24 h，孢子开始萌发，原生质转移到芽管生长点，芽管自孢子一端或二端或四周均有伸出。48 h菌体呈网状，形成黄色菌团或散生。60 h菌体出现产孢结构，开始形成液生芽孢子，芽孢子呈长卵形。72 h后芽孢子大量形成，部分芽孢子以微循环产孢方式，直接从芽孢子上形成分生孢子，液生分生孢子卵球形，与气生分生孢子有明显差异，此后液生分生孢子产量逐渐增加，120～144 h达到最高产量。
2.2 不同浓度吐温80对生物量、液生孢子形成的影响
表2为不同浓度吐温80培养液振荡培养144 h后生物量及液生分生孢子产孢情况。经方差分析可知，吐温80对生物量影响不显著，F=0.54
2.3 不同维生素对生物量、液生孢子形成的影响
表3为不同维生素培养液振荡培养144 h后生物量及液生分生孢子产孢情况。经方差分析可知，不同维生素对生物量影响极显著，F=5.45>F0.01（24，50）=2.18。不同维生素对液生芽孢子的形成影响达极显著水平，F=28.39>F0.01（24，50）=2.18。不同维生素对液生分生孢子的产量影响极显著，F=12.46>F0.01（9，20）=2.18。不同维生素对生物量、液生芽孢子、液生分生孢子的产量影响极显著，生长良好状况有复合维生素、B2B1B6、B6B1H等。复杂的维生素组合比单一的维生素液分生孢子的产量高，未添加维生素的对照组产孢量最低。
3 结论与讨论
不同浓度吐温80对绿僵菌液生分生孢子的产量影响差异极显著，培养基中吐温80含量在0.6%～1.0%，可获最大产孢量。适宜吐温含量，培养液的黏稠度适中，菌体不易徒长，与此同时又形成发育良好的菌丝团，产孢结构发育充分，产孢点多，产孢量大。
不同维生素对绿僵菌生物量、液生分生孢子的产量影响差异极显著，生长良好状况有复合维生素、B2B1B6、B6B1H等。可见，培养液中添加适宜的维生素作为生长辅助因子，能有效促进生物量、液生芽孢子和液生分生孢子的产量，从而构成一条良好的产孢路线，为进一步研究液体深层发酵产生绿僵菌分生孢子提供参考价值。
4 参考文献
[1] 樊美珍，郭超，薛文奇，等.金龟子绿缰菌液体深层培养初探[J].中国虫草真菌研究与应用，1993（3）：146-149.
[2] 宋漳.九株绿僵菌液体振荡培养初步研究[J].福建林学院报，1996，16（1）：38-40.
[3] VEZINA C，SINGMH K，SEHGALS N.Sporulation of filamentous fungi in submerged culture[J].Mycologia，1965，57（5）：722-736.
[4] 叶小真，陈全助，宋漳.10种化学杀虫剂对金龟子绿僵菌生物学性状的影响[J].福建林学院学报，2012，32（2）：169-173.
[5] 王丹琪，叶素丹，陈春.新型旋风分离器高效分离多株生防真菌分生孢子[J].中国生物防治学报，2013（1）：61-67.
[6] 宋漳，叶小真，叶斌.液固两相法培养金龟子绿僵菌的研究[J].福建林学院学报，2012，32（2）：163-168.