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摘 要：为筛选对舒伯特气单胞菌（Aeromonas schubertii）具有较好杀菌效果的消毒剂及其最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），选用五种消毒剂（聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘）进行杀菌实验，设置舒伯特气单胞菌母液浓度为（1～2）×103 cfu/mL，五种消毒剂目标浓度均为0.3750 mg/L。研究结果表明，双链季铵盐碘对舒伯特气单胞菌杀菌效果最好，杀菌率为63.02%;其次是复合碘，杀菌率为43.56%。当双链季铵盐碘和复合碘两种消毒剂浓度为目标浓度3倍（1.1250 mg/L）时，可全部杀灭舒伯特气单胞菌。因此，五种消毒剂对舒伯特气单胞菌都具有一定的杀菌效果，依次为：双链季铵盐碘>复合碘>二氧化氯>大蒜素，其中双链季铵盐碘和复合碘的效果最好，其最小杀菌浓度（MBC）为1.1250 mg/L。
关键词：舒伯特气单胞菌;消毒剂;目标浓度;最小杀菌浓度
中图分类号：S948
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2019）03-0089-04 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.017
Abstract：In order to screen the disinfectant with good bactericidal effect on Aeromonas schubertii and find out the Minimum Bactericidal Concentration （MBC） of five disinfectant （Polyvidone iodine，Double-chain quaternary ammonium iodide，Alicin，Chloride dioxide and Compound iodine） were selected. for sterilization experiments. The concentration of A. schubertii was set to （1～2）×103 cfu/mL，and the target concentration of five disinfectants was 0.3750 mg/L. The results showed that the double-stranded quaternary ammonium iodine had the best bactericidal effect on A. schubertii，and the bactericidal rate was 63.02%. The second was iodine，and the bactericidal rate was 43.56%. Meanwhile，both Double-chain quaternary ammonium iodide and the Compound iodine demonstrated 100% bactericidal rate when the concentration of the disinfectant was 3 times （1.1250 mg/L） of the target concentration. Therefore，all of the five disinfectants have certain taking effects on A. schubertii，in an order followed by：Double-chain quaternary ammonium Iodide>Compound iodide>Chloride iodide>Alicin>Polyvidone iodide，of which double-stranded quaternary ammonium salt iodine and complex Iodine has the best effect and its minimum bactericidal concentration （MBC） is 1.1250 mg/L.
Key words：Aeromonas schuberii; sterilant; target concentration; minimum bactericidal concentration
舒伯特气单胞菌（Aeromonas schubertii）属气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromanas），为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，是水产动物的常见致病菌[1]。目前，有报道对乌鳢源舒伯特气单胞菌WL-4菌株的生理生化、生长特性、致病因子等生物学特征，药物的敏感性及分子生物学检测方法[2-5]。另有研究表明，舒伯特气单胞菌对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感，对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受[6-8]。然而，在养殖生产中舒伯特气单胞菌感染鱼类时有发生，往往损失惨重[9]。为了提高乌鳢养殖生产效益，开展消毒剂对舒伯特气单胞菌的杀菌实验，筛选出具有较好杀菌效果的消毒剂并明确其最小杀菌浓度，旨在降低该菌引发疾病的养殖风险。
1 材料与方法
1.1 消毒剂与实验菌株
五种消毒剂分别为：聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘。
实验用舒伯特气单胞菌菌株由佛山市顺德区活宝源生物科技有限公司提供。
1.2 實验方法
1.2.1 细菌母液的制备
取适量舒伯特气单胞菌接种于营养肉汤中，28℃培养24 h，使细菌母液为1～2麦氏单位备用。 1.2.2 消毒劑的制备
配制目标浓度为0.3750 mg/L的消毒剂：分别取不同消毒剂3.75 g加蒸馏水溶解定容于100 mL的容量瓶中，摇匀取1 mL加入1 L的容量瓶，转移到不透光样品瓶中密封保存备用。配制消毒剂需全程避光，现配现用。
1.2.3 消毒剂对舒伯特气单胞菌的杀菌实验
实验在无菌环境下进行，每组设置2个平行处理（A组、B组），无菌试管逐次标记编号A1～A6，B1～B6备用。将细菌母液稀释100倍后，从中取1 mL置于已灭菌的锥形瓶（500 mL）中，瓶中装有200 mL蒸馏水和玻璃珠，封口后放于摇床上震荡15 min，频率为200 r/min。取10 mL稀释母液分别加入各无菌试管中，按1～6#再依次加入100 μL的聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘、无菌蒸馏水，混匀避光反应45 min后，从各试管中取100 μL分别置于相应营养琼脂培养皿（50℃），摇匀放于37℃恒温培养16 h后计数。
杀菌率=（对照组活菌数-实验组活菌数）/对照组活菌数×100%
1.2.4 消毒剂对舒伯特气单胞菌的浓度梯度实验
菌液的配置、操作和杀菌率计算与1.2.4同。选用杀菌效果好的消毒剂进行浓度梯度实验。实验中消毒剂浓度分别设置为目标浓度的1.5倍（0.5625 mg/L）、2倍（0.7500 mg/L）、2.5倍（0.9375 mg/L）、3倍（1.1250 mg/L）、3.5倍（1.3125 mg/L）、4倍（1.5000 mg/L），每组设置2个处理，对照组加250 μL的无菌蒸馏水。
1.3 数据处理
使用Office 2007办公软件统计分析数据，数据用平均值±标准差（Mean±SD）表示。
2 结果与分析
2.1 消毒剂对舒伯特气单胞菌的杀菌效果
与对照组相比，各消毒剂对该细菌均有一定的抑制杀灭作用（见表1），其中双链季铵盐碘和复合碘对该菌的杀菌效果最好，杀菌率分别为63.02%（60.14%～65.85%）和43.56%（38.21%～49.01%）。五种消毒剂的抑菌杀菌效果从高到低依次为：双链季铵盐碘>复合碘>二氧化氯>大蒜素>聚维酮碘。
2.2 消毒剂对舒伯特气单胞菌的最小杀菌浓度
双链季铵盐碘和复合碘消毒剂的浓度梯度实验结果见表2，当浓度为1.1250 mg/L时，杀菌率为100%。
3 结论与讨论
舒伯特气单胞菌所引起的内脏类结节病是鳢科鱼类常见疾病之一，舒伯特气单胞菌对鳢科鱼类的养殖存在很大的威胁[10]。聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘是水产养殖中的常用消毒剂。谭凤霞和吴全超[11-12]研究表明，聚维酮碘、二氧化氯在低浓度下对气单胞菌有一定的抑制作用。杜仲大蒜制剂对鱼类常见病原菌的抑菌作用中得出大蒜素及制剂对鱼害粘球菌、肠型点状气单胞菌和荧光假单胞菌均有一定的抑菌作用[13]。在本研究中，当浓度0.3750 mg/L时，五种消毒剂对舒伯特气单胞菌均有抑制作用;当浓度为1.1250 mg/L时，双链季铵盐和复合碘这两种消毒剂杀菌率均为100%，双链季铵盐消毒剂在低浓度、短时间内对多重耐药型革兰阳性球菌的杀灭效果显著有关[14]。双链季铵盐类化合物是一种阳离子表面活性剂，通过在水中形成带正电荷的物质，吸附于带负电荷的微生物表面，形成微团，通过渗透作用进入细胞膜的类脂层来改变膜的渗透性，从而达到杀菌作用[15-18]。复合碘可释放出碘分子（I2），氧化菌体蛋白的活性基团，并与蛋白中的氨基酸结合而导致蛋白变性和抑制菌体的代谢酶系统，促使病原体崩解死亡[19]。韦艳等[20]研究表明复合碘对气单胞菌的MBC浓度大于512 mg/L，本实验中复合碘对舒伯特气单胞菌的最小杀菌浓度较低，这可能与菌种的不同及其耐药性有关。舒伯特气单胞菌对五种消毒剂的耐药性有待后续深入研究。
参 考 文 献：
[1] 刘向前，申作江，陈建文，等.一起由舒伯特气单胞菌引起的食物中毒调查报告[J].现代预防医学，1999（04）：536-537.
[2] 莫金凤.复方中草药对杂交鳢生长、肉品质及抗细菌感染能力的影响[D].2016.
[3] 莫金凤，姜 兰，吴灶和.乌鳢源舒伯特气单胞菌生物学特性及其药物敏感性分析[J].水产学报，2016，40（03）：484-494.
[4] 刘 春，李凯彬，王 庆，等.鱼致病性舒伯特气单胞菌双重PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014，36（01）：54-57.
[5] 周 阳.舒伯特气单胞菌全基因组的比较分析[A].中国水产学会.2017年中国水产学会学术年会论文摘要集[C].中国水产学会：中国水产学会，2017：1.
[6] 刘 春.鳢舒伯特气单胞菌内脏类结节病的研究[A].中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会.中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会：中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会，2012：7.
[7] 刘 春，李凯彬，王 庆，等.杂交鳢（斑鳢♀×乌鳢♂）内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析[J].水产学报，2012，36（7）：1119-1125.
[8] Carnahan A M，Marii M A，Fanning G R，et al. Characterization of Aeromonas schubertii strains recently isolated form traumatic wound infections[J].Journal of Clinical Microbiology，1989，27（8）：1826-1830. [9] 雷 燕，肖 洋，杨慧英.真鲷虹彩病毒和舒伯特气单胞菌混合感染引起美国红鱼死亡[J].海洋与渔业：水产前沿，2012（10）：58-58.
[10] 周 梦.抑杀杂交鳢源舒伯特气单胞菌的中草药筛选与应用[D].重庆：西南大学，2016.
[11] 谭凤霞.聚维酮碘对气单胞菌的抑菌杀菌效果研究[J].安徽农业科学，2011，39（29）：17955-17956，17962.
[12] 谭凤霞，吴全超.二氧化氯对气单胞菌的抑菌和杀菌效果研究[J].湖北农业科学，2012，51（03）：567-570.
[13] 罗庆华，黄欢喜，刘清波.杜仲大蒜制剂对鱼类常见病原菌的抑菌作用[J].水利渔业，2006（06）：86-88.
[14] 彭燕琼，王 月，贾 珉，等.双链季铵盐对多重耐药型球菌的消毒效果观察[J].中国卫生检验杂志，2018，28（20）：2442-2445.
[15] Denyer S P，Stewart G S A B. Mechanisms of action of disinfectants[J].Intern Biodeterioration and Biodegradation，1998，41（3-4）：261-268.
[16] 倪语星，糜琛蓉.细菌耐药现状与耐药细菌的预防控制策略[J].中华检验医学杂志，2012，35（8）：682-684.
[17] 任 哲，魏秋华，苏裕心，等.MRSA对6种消毒剂耐药性及相关抗性基因的比较研究[J].中国消毒学杂志，2012，29（3）：173-175.
[18] Yuen J W，Chung T W，Loke A Y，Yuen，John W M，Chung，et al. IJERPH，Vol. 12，P 3026-3041：Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus（MRSA）Contamination in Bedside Surfaces of a Hospital Ward and the Potential Effectiveness of Enhanced Disinfection with an Antimicrobial Polymer Surfactant[J].International Journal of Environrmental Research and Public Health，2015，12（3）：3026-3041.
[19] 柳富榮.养殖水体消毒剂（3）[J].湖南农业，2015（11）：17.
[20] 韦 艳，李传慰，祭仲石.4种消毒剂对气单胞菌的抑菌杀菌效果研究[J].中国水产，2018（02）：95-97.
关键词：舒伯特气单胞菌;消毒剂;目标浓度;最小杀菌浓度
中图分类号：S948
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2019）03-0089-04 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.017
Abstract：In order to screen the disinfectant with good bactericidal effect on Aeromonas schubertii and find out the Minimum Bactericidal Concentration （MBC） of five disinfectant （Polyvidone iodine，Double-chain quaternary ammonium iodide，Alicin，Chloride dioxide and Compound iodine） were selected. for sterilization experiments. The concentration of A. schubertii was set to （1～2）×103 cfu/mL，and the target concentration of five disinfectants was 0.3750 mg/L. The results showed that the double-stranded quaternary ammonium iodine had the best bactericidal effect on A. schubertii，and the bactericidal rate was 63.02%. The second was iodine，and the bactericidal rate was 43.56%. Meanwhile，both Double-chain quaternary ammonium iodide and the Compound iodine demonstrated 100% bactericidal rate when the concentration of the disinfectant was 3 times （1.1250 mg/L） of the target concentration. Therefore，all of the five disinfectants have certain taking effects on A. schubertii，in an order followed by：Double-chain quaternary ammonium Iodide>Compound iodide>Chloride iodide>Alicin>Polyvidone iodide，of which double-stranded quaternary ammonium salt iodine and complex Iodine has the best effect and its minimum bactericidal concentration （MBC） is 1.1250 mg/L.
Key words：Aeromonas schuberii; sterilant; target concentration; minimum bactericidal concentration
舒伯特气单胞菌（Aeromonas schubertii）属气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromanas），为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，是水产动物的常见致病菌[1]。目前，有报道对乌鳢源舒伯特气单胞菌WL-4菌株的生理生化、生长特性、致病因子等生物学特征，药物的敏感性及分子生物学检测方法[2-5]。另有研究表明，舒伯特气单胞菌对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感，对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受[6-8]。然而，在养殖生产中舒伯特气单胞菌感染鱼类时有发生，往往损失惨重[9]。为了提高乌鳢养殖生产效益，开展消毒剂对舒伯特气单胞菌的杀菌实验，筛选出具有较好杀菌效果的消毒剂并明确其最小杀菌浓度，旨在降低该菌引发疾病的养殖风险。
1 材料与方法
1.1 消毒剂与实验菌株
五种消毒剂分别为：聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘。
实验用舒伯特气单胞菌菌株由佛山市顺德区活宝源生物科技有限公司提供。
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1.2.1 细菌母液的制备
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配制目标浓度为0.3750 mg/L的消毒剂：分别取不同消毒剂3.75 g加蒸馏水溶解定容于100 mL的容量瓶中，摇匀取1 mL加入1 L的容量瓶，转移到不透光样品瓶中密封保存备用。配制消毒剂需全程避光，现配现用。
1.2.3 消毒剂对舒伯特气单胞菌的杀菌实验
实验在无菌环境下进行，每组设置2个平行处理（A组、B组），无菌试管逐次标记编号A1～A6，B1～B6备用。将细菌母液稀释100倍后，从中取1 mL置于已灭菌的锥形瓶（500 mL）中，瓶中装有200 mL蒸馏水和玻璃珠，封口后放于摇床上震荡15 min，频率为200 r/min。取10 mL稀释母液分别加入各无菌试管中，按1～6#再依次加入100 μL的聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘、无菌蒸馏水，混匀避光反应45 min后，从各试管中取100 μL分别置于相应营养琼脂培养皿（50℃），摇匀放于37℃恒温培养16 h后计数。
杀菌率=（对照组活菌数-实验组活菌数）/对照组活菌数×100%
1.2.4 消毒剂对舒伯特气单胞菌的浓度梯度实验
菌液的配置、操作和杀菌率计算与1.2.4同。选用杀菌效果好的消毒剂进行浓度梯度实验。实验中消毒剂浓度分别设置为目标浓度的1.5倍（0.5625 mg/L）、2倍（0.7500 mg/L）、2.5倍（0.9375 mg/L）、3倍（1.1250 mg/L）、3.5倍（1.3125 mg/L）、4倍（1.5000 mg/L），每组设置2个处理，对照组加250 μL的无菌蒸馏水。
1.3 数据处理
使用Office 2007办公软件统计分析数据，数据用平均值±标准差（Mean±SD）表示。
2 结果与分析
2.1 消毒剂对舒伯特气单胞菌的杀菌效果
与对照组相比，各消毒剂对该细菌均有一定的抑制杀灭作用（见表1），其中双链季铵盐碘和复合碘对该菌的杀菌效果最好，杀菌率分别为63.02%（60.14%～65.85%）和43.56%（38.21%～49.01%）。五种消毒剂的抑菌杀菌效果从高到低依次为：双链季铵盐碘>复合碘>二氧化氯>大蒜素>聚维酮碘。
2.2 消毒剂对舒伯特气单胞菌的最小杀菌浓度
双链季铵盐碘和复合碘消毒剂的浓度梯度实验结果见表2，当浓度为1.1250 mg/L时，杀菌率为100%。
3 结论与讨论
舒伯特气单胞菌所引起的内脏类结节病是鳢科鱼类常见疾病之一，舒伯特气单胞菌对鳢科鱼类的养殖存在很大的威胁[10]。聚维酮碘、双链季铵盐碘、大蒜素、二氧化氯、复合碘是水产养殖中的常用消毒剂。谭凤霞和吴全超[11-12]研究表明，聚维酮碘、二氧化氯在低浓度下对气单胞菌有一定的抑制作用。杜仲大蒜制剂对鱼类常见病原菌的抑菌作用中得出大蒜素及制剂对鱼害粘球菌、肠型点状气单胞菌和荧光假单胞菌均有一定的抑菌作用[13]。在本研究中，当浓度0.3750 mg/L时，五种消毒剂对舒伯特气单胞菌均有抑制作用;当浓度为1.1250 mg/L时，双链季铵盐和复合碘这两种消毒剂杀菌率均为100%，双链季铵盐消毒剂在低浓度、短时间内对多重耐药型革兰阳性球菌的杀灭效果显著有关[14]。双链季铵盐类化合物是一种阳离子表面活性剂，通过在水中形成带正电荷的物质，吸附于带负电荷的微生物表面，形成微团，通过渗透作用进入细胞膜的类脂层来改变膜的渗透性，从而达到杀菌作用[15-18]。复合碘可释放出碘分子（I2），氧化菌体蛋白的活性基团，并与蛋白中的氨基酸结合而导致蛋白变性和抑制菌体的代谢酶系统，促使病原体崩解死亡[19]。韦艳等[20]研究表明复合碘对气单胞菌的MBC浓度大于512 mg/L，本实验中复合碘对舒伯特气单胞菌的最小杀菌浓度较低，这可能与菌种的不同及其耐药性有关。舒伯特气单胞菌对五种消毒剂的耐药性有待后续深入研究。
参 考 文 献：
[1] 刘向前，申作江，陈建文，等.一起由舒伯特气单胞菌引起的食物中毒调查报告[J].现代预防医学，1999（04）：536-537.
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[7] 刘 春，李凯彬，王 庆，等.杂交鳢（斑鳢♀×乌鳢♂）内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析[J].水产学报，2012，36（7）：1119-1125.
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[12] 谭凤霞，吴全超.二氧化氯对气单胞菌的抑菌和杀菌效果研究[J].湖北农业科学，2012，51（03）：567-570.
[13] 罗庆华，黄欢喜，刘清波.杜仲大蒜制剂对鱼类常见病原菌的抑菌作用[J].水利渔业，2006（06）：86-88.
[14] 彭燕琼，王 月，贾 珉，等.双链季铵盐对多重耐药型球菌的消毒效果观察[J].中国卫生检验杂志，2018，28（20）：2442-2445.
[15] Denyer S P，Stewart G S A B. Mechanisms of action of disinfectants[J].Intern Biodeterioration and Biodegradation，1998，41（3-4）：261-268.
[16] 倪语星，糜琛蓉.细菌耐药现状与耐药细菌的预防控制策略[J].中华检验医学杂志，2012，35（8）：682-684.
[17] 任 哲，魏秋华，苏裕心，等.MRSA对6种消毒剂耐药性及相关抗性基因的比较研究[J].中国消毒学杂志，2012，29（3）：173-175.
[18] Yuen J W，Chung T W，Loke A Y，Yuen，John W M，Chung，et al. IJERPH，Vol. 12，P 3026-3041：Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus（MRSA）Contamination in Bedside Surfaces of a Hospital Ward and the Potential Effectiveness of Enhanced Disinfection with an Antimicrobial Polymer Surfactant[J].International Journal of Environrmental Research and Public Health，2015，12（3）：3026-3041.
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[20] 韦 艳，李传慰，祭仲石.4种消毒剂对气单胞菌的抑菌杀菌效果研究[J].中国水产，2018（02）：95-97.