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摘要：目的：探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮2’-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine）对人肺腺癌细胞株A549增殖作用的影响。方法：应用不同浓度（1uM、4uM、16uM、64uM）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2'-deoxycytidine，处理人肺腺癌细胞株A549，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定5-aza-2'-deoxycytidine作用下对A549细胞株的抑制率。结果：不同药物浓度组在同一作用时间下，细胞株生存率差异有统计学意义（P<0.05） 结论：5-aza-2'-deoxycytidine有抑制人肺腺癌细胞株A549生长的作用，抑制作用呈浓度依赖性。
关键词：甲基化；5-aza-2'-deoxycytidine；A549
【中图分类号】R329.2+6 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）03-0293-02
肺癌是最为常见，我国增长最快的恶性肿瘤。多种机制参与肺癌的发生，DNA 甲基化是其中发病机制之一。 5-aza-2'-deoxycytidine可通过DNA去甲基化发挥抑癌作用。
1 材料与方法
1.1 材料 人肺腺癌细胞株A549由实验室保存，RPMI 1640 培养基、胎牛血清（美国Gibico公司），5-aza-2'-deoxycytidine（美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（美国Amresco公司）。
1.2 设备 医用洁净工作台（美国Baker公司），连续光谱酶标仪（美国Molecular Devices公司）
1.3 细胞培养及药物处理
1.3.1 试剂配置 5-aza-2'-deoxycytidine用DMSO溶解配成浓度为2.2×105uM的储存液，-20°C保存。MTT溶于PBS中，过滤除菌，浓度为5mg/ml，避光冷藏。
1.3.2 细胞培养 A549培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37°C、5%CO2培养箱中培养，每2-3天传代1次。选用对数生长期细胞用于实验。
1.3.3 MTT法 将对数生长期细胞以1×104个/孔的密度接种于无菌96孔培养板，每孔体积为180ul。过夜贴壁后，每孔各自加入20ul 5-aza-2'-deoxycytidine使终浓度为1uM、4uM、16uM、64uM，以不加药物为阴性对照组，终体积200ul。每种浓度设6个复孔，于37℃、5%CO2条件下培养处理72h后每孔加入5g/L的MTT，培养4 h后，去培养基，每孔加入DMSO 80ul，震荡10min，待紫蓝色结晶完全溶解，酶标仪570nm波长测吸光度值。细胞生长抑制率=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%，以上实验重复三次。以细胞生长抑制率（%）为纵坐标，作用时间为横坐标，绘制生长曲线。
2 结果
MTT 检测发现5-aza-2'-deoxycytidine对人肺腺癌细胞株A549细胞增殖的抑制作用呈浓度（1uM-64uM）依赖性；呈时间依赖性（24h-96h），见图1。
3 讨论
DNA去甲基化治疗已被证实在白血病AML、CML等的治疗中取得较好疗效。5-aza-2'-deoxycytidine在多种肿瘤细胞株中，逆转了RASSF1A、Rb、APC等多个抑癌基因启动子的甲基化状态，而有效地抑制了肿瘤的发展[1-3]。
本研究中A549经过5-aza-2'-deoxycytidine处理后，细胞增殖受到不同程度的抑制。5-aza-2'-deoxycytidine在浓度为1uM时即可抑制A549的增殖，在1-64uM范围内，其抑制作用呈浓度依赖性。5-aza-2'-deoxycytidine可能使A549中某些抑癌基因去甲基化而重新表达，恢复了其抑癌功能，从而起到抑制人肺癌细胞株A549的生长的作用。
综上所述，5-aza-2'-deoxycytidine在对人肺癌A549有抑制增殖作用，但其机制有待进一步研究。
参考文献
[1] Zych J， Stimamiglio MA， Senegaglia AC， et al. The epigenetic modifiers 5-aza-2'-deoxycytidine and trichostatin A influence adipocyte differentiation in human mesenchymal stem cells[J]. Braz J Med Biol Res. 2013 May； 46（5）： 405-416.
[2] Liu R， Zhang XH， Zhang K， et al. 5-Aza-2''-deoxycytidine inhibits retinoblastoma cell by reactivating epigenetically silenced RASSF1A gene[J]. Int J Ophthalmol. 2014 Feb 18； 7（1）： 51-56.
[3] Shao G， Berenguer J， Borczuk AC， et al. Epigenetic inactivation of Betaigh3 gene in human cancer cells. Cancer Res， 2006， 66 （9）： 4566-4573.
关键词：甲基化；5-aza-2'-deoxycytidine；A549
【中图分类号】R329.2+6 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）03-0293-02
肺癌是最为常见，我国增长最快的恶性肿瘤。多种机制参与肺癌的发生，DNA 甲基化是其中发病机制之一。 5-aza-2'-deoxycytidine可通过DNA去甲基化发挥抑癌作用。
1 材料与方法
1.1 材料 人肺腺癌细胞株A549由实验室保存，RPMI 1640 培养基、胎牛血清（美国Gibico公司），5-aza-2'-deoxycytidine（美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（美国Amresco公司）。
1.2 设备 医用洁净工作台（美国Baker公司），连续光谱酶标仪（美国Molecular Devices公司）
1.3 细胞培养及药物处理
1.3.1 试剂配置 5-aza-2'-deoxycytidine用DMSO溶解配成浓度为2.2×105uM的储存液，-20°C保存。MTT溶于PBS中，过滤除菌，浓度为5mg/ml，避光冷藏。
1.3.2 细胞培养 A549培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37°C、5%CO2培养箱中培养，每2-3天传代1次。选用对数生长期细胞用于实验。
1.3.3 MTT法 将对数生长期细胞以1×104个/孔的密度接种于无菌96孔培养板，每孔体积为180ul。过夜贴壁后，每孔各自加入20ul 5-aza-2'-deoxycytidine使终浓度为1uM、4uM、16uM、64uM，以不加药物为阴性对照组，终体积200ul。每种浓度设6个复孔，于37℃、5%CO2条件下培养处理72h后每孔加入5g/L的MTT，培养4 h后，去培养基，每孔加入DMSO 80ul，震荡10min，待紫蓝色结晶完全溶解，酶标仪570nm波长测吸光度值。细胞生长抑制率=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%，以上实验重复三次。以细胞生长抑制率（%）为纵坐标，作用时间为横坐标，绘制生长曲线。
2 结果
MTT 检测发现5-aza-2'-deoxycytidine对人肺腺癌细胞株A549细胞增殖的抑制作用呈浓度（1uM-64uM）依赖性；呈时间依赖性（24h-96h），见图1。
3 讨论
DNA去甲基化治疗已被证实在白血病AML、CML等的治疗中取得较好疗效。5-aza-2'-deoxycytidine在多种肿瘤细胞株中，逆转了RASSF1A、Rb、APC等多个抑癌基因启动子的甲基化状态，而有效地抑制了肿瘤的发展[1-3]。
本研究中A549经过5-aza-2'-deoxycytidine处理后，细胞增殖受到不同程度的抑制。5-aza-2'-deoxycytidine在浓度为1uM时即可抑制A549的增殖，在1-64uM范围内，其抑制作用呈浓度依赖性。5-aza-2'-deoxycytidine可能使A549中某些抑癌基因去甲基化而重新表达，恢复了其抑癌功能，从而起到抑制人肺癌细胞株A549的生长的作用。
综上所述，5-aza-2'-deoxycytidine在对人肺癌A549有抑制增殖作用，但其机制有待进一步研究。
参考文献
[1] Zych J， Stimamiglio MA， Senegaglia AC， et al. The epigenetic modifiers 5-aza-2'-deoxycytidine and trichostatin A influence adipocyte differentiation in human mesenchymal stem cells[J]. Braz J Med Biol Res. 2013 May； 46（5）： 405-416.
[2] Liu R， Zhang XH， Zhang K， et al. 5-Aza-2''-deoxycytidine inhibits retinoblastoma cell by reactivating epigenetically silenced RASSF1A gene[J]. Int J Ophthalmol. 2014 Feb 18； 7（1）： 51-56.
[3] Shao G， Berenguer J， Borczuk AC， et al. Epigenetic inactivation of Betaigh3 gene in human cancer cells. Cancer Res， 2006， 66 （9）： 4566-4573.