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摘要 来源于链霉菌属噬菌体（streptomyces phage）的phiC31定点重组酶系统可诱导重组位点attB（细菌基因组）和attP（噬菌体）之间DNA序列的重组，该重组酶是继Cre/lox重组酶系统和FLP/frt重组酶系统之后的又一种新型位点重组酶系统，在原核和真核生物基因整合、删除和倒位等方面得到广泛应用。文中主要对phiC31重组酶系统的来源、结构特性以及在植物转基因中的应用研究进展进行综述，为phiC31定点重组酶的进一步开发利用提供依据。
关键词 phiC31重组酶系统；基因整合；基因删除；基因倒位
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01298-04
Abstract phiC31 sitespecific recombination system that derived from Streptomyces phage can mediate recombination of the DNA sequences between the recognition sites of attB site （from bacterial genome） and attP site （from phage）， which is one of new type sitespecific recombinant system discovered after Cre/lox recombinant system and FLP/frt reorganization system， which has been widely used in gene integration， gene elimination and DNA inversion in prokaryotic and eukaryotic organism. This review described the origin， structural characteristics of the phiC31 sitespecific recombinant system and its applications in plant transgenic research.
Key words phiC31 sitespecific recombination system； Gene integration； Gene elimination； Gene inversion
位點特异重组酶系统（site-specific recombination system）是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。整个系统主要由2个部分构成：重组酶和特异性识别位点。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，不能催化其他任何2条同源或非同源序列之间的重组，重组具有高度的特异性和保守性。在生物体内或者离体细胞中，位点重组酶均能诱导特定识别位点之间的基因序列发生高效、精确的重组反应，获得稳定的重组产物[1]。根据重组酶特异识别位点在染色体上的位置以及两个识别序列的排列方向，重组发生后可产生以下3种结果：①当重组识别位点位于不同的染色体上时，重组导致2条染色体发生易位、交换；②当重组识别位点位于同一染色体上且排列方向一致时，识别位点之间的DNA序列被删除；③当重组识别位点位于同一染色体上且排列方向相反时，重组后导致识别位点间DNA序列发生倒位[2]（图1）。目前，来自Pl噬菌体Cre/lox [3]、酵母2μ质粒FLP/frt[4]和链霉菌属噬菌体phiC31[5]等重组酶系统的重组功能已在原核生物、动物、植物等多种生物体中得到了验证。
根据重组酶氨基酸的同源性以及催化产物的生化特性，重组酶分为酪氨酸重组酶（tyrosine recombinase）和丝氨酸重组酶（serine recombinase）2大类。其中，酪氨酸重组酶又称为“λ重组酶”家族，在酪氨酸重组酶的催化结构域中，都有一个保守的酪氨酸残基负责攻击核苷酸骨架结构，出现单链断裂切口，产生5-OH末端和3-磷酸基-络氨酸的切割中间体，类似于同源重组中产生的Holliday模型[6]。Cre/lox和FLP/frt重组酶系统是该家族中具有代表性的2个成员。丝氨酸重组酶具有更为保守的催化结构域，其近N端为活性区域，包含一个丝氨酸，该丝氨酸残基攻击DNA骨架使其交错切割，形成3-OH的双链断裂末端，而5-磷酸基与重组酶共价键连接形成联会中间体，随后发生翻转再重新连接，该重组过程类似于双链断裂重组模型（double-stand breakage）[7]。文中主要介绍的phiC31重组系统即是来源于该类家族中分子量较大的大型丝氨酸重组酶的亚家族[8]。
1 噬菌体phiC31重组酶重组特点
噬菌体phiC31重组酶由613个氨基酸构成，能够识别来自噬菌体自身的attP（39 bp）位点和来自细菌基因组的attB（34 bp）位点。attP和attB识别位点均具有7 bp的核心序列（crossover site）及位于其核心序列两侧7 bp的反向重复序列（inverted repeats）（attP中称C、C′，attB中称B、B′）。其中的attP位点还包含臂型结合位点（arm-type sites，分别为P1、P2、P′1、P′2和P′3）。重组过程中，上述结合位点均参与phiC31重组酶的结合。此外，还包括3个宿主因子（Integration host factor，IHF；分别为H1、H2和H′）、3个解离酶（excisionase， Xis）结合位点以及1个辅助因子（factor for invertion stimulation， Fis）结合位点[9]。上述复杂的phiC31重组酶识别序列组成，保证了phiC31重组酶介导重组反应的精确进行。在Cre/lox系统和FLP/frt系统中，重组酶识别位点除了核心序列（8 bp）和两侧完全对称的反向重复序列外，没有其他任何辅助因子的结合位点，且重组反应发生前后识别位点基因序列不会发生改变，由于生物体内时刻进行着分子间的相互作用，在相应重组酶存在的条件下，重组反应会向着删除和整合2个方向同时进行，即Cre/lox系统和FLP/frt系统所诱导的重组反应是可逆的。通过对Cre/lox系统中识别位点的改造，Albert等设计了缩短的loxP位点，有效降低了逆向重组反应的进行，但同时其正向重组效率也被大大降低[10]。而phiC31重组酶体系，不仅对酶底物DNA的核心序列同源性要求十分严格，且识别位点attP与attB自身即为结构具有差异的结合位点，重组发生后产生phiC31重组酶不能识别的attR和attL序列，从而严格控制重组反应的单方向进行[11]。 2 噬菌体phiC31重组酶系统在植物转基因中的应用
2.1 噬菌体phiC31重组酶介导的基因定点整合
从20世纪80年代以来，人类成功实现外源目的基因导入植物细胞基因组中并稳定表达后，转基因技术被广泛应用于农产品的商业化生产，在世界范围25个国家生产出13 400万t的转基因农产品[12]。研究表明，外源基因的插入位点会影响目的基因表达的水平以及表达的稳定性，即所谓的位置效应。因此研究者在如何将外源基因精确导入宿主细胞基因组中以及解决基因沉默等问题上进行了深入的探索与研究。在植物基因工程操作中，利用位点重组酶系统可实现外源基因的精确、单拷贝的插入[10]。
目前，基于重组酶介导的特定位点间的重组反应已经被广泛应用在外源DNA整合到哺乳动物细胞、酵母细胞和高等植物细胞核基因组中[13-14]。Vergunst等最早利用Cre/lox重组酶系统，实现了将T-DNA整合到拟南芥染色体上预期位置。首先获得一个35S-loxP-Cre目标转基因植株（Target line），该植株表达Cre重组酶。随后2次转化的整合载体T-DNA含一个loxP –NPTII- loxP结构，在Cre重组酶参与下发生位点间的重组，整合载体中的loxP-NPTII- loxP替换位于Target line中35S启动子下游的Cre基因表达盒，NPTII基因上游获得35S启动子而得到表达，成功整合的个体获得对卡拉霉素的抗性[15]。然而，基于Target line 上单一的识别位点的基因整合将导致2次转化载体上的非目标序列的同时整合。Louwerse 等利用loxP和改造的lox5171识别位点，在Cre重组酶的参与下实现两位点间表达盒的交换，即RMCE（recombinase-mediated cassette exchage）[16]。将Bar基因表达盒置于2个反向排列的loxP和lox5171位点之间，并置于35S启动子的下游转化拟南芥后获得Target line。上游缺少启动子的NPTII编码框被同样置于2个反向排列的loxP和lox5171位点之间2次转化Target line，Cre介导RMCE后，NPTII基因取代Target line中的Bar基因，在含有卡那霉素的培养基上，盒交换发生的植株将被优先筛选，从而在拟南芥中实现稳定的RMCE。
相对上述Cre/lox重组系统，phiC31重组酶系统具有的单向重组特点，在基因定点整合和RMCE中的应用具有更好的前景。Lutz等将phiC31重组酶系统与Cre/lox重组酶系统相结合将目标基因精确整合到烟草叶绿体基因组中[17]。在该项研究中，首先将一个attB位点以及位于loxP位点之间的壮观霉素抗性基因aadA通过基因枪转化方法导入烟草叶绿体，然后将Cre重组酶基因通过农杆菌转化法导入上述植株，Cre重组酶表达后，删除了位于loxP位点间的aadA标记基因，获得叶绿体基因组不含aadA筛选标记基因的但具有attB/loxP位点的转基因植株。利用农杆菌介导的转化法，该植株随后被导入重组酶phiC31基因。构建含有attP位点并与卡那霉素抗性基因neo连锁质粒载体，基因枪转化法导入上述植株。结果从转化的45个叶片中获得237株对卡那霉素具有抗性的独立株系；对其中113株进行检测，在81株中检测到与attP位点连锁的neo基因被整合到受体植株叶绿体基因组的attB位点处，整合效率大约为72%。另外，在烟草细胞中的瞬时表达phiC31重组酶，也成功将壮观霉素抗性基因aadA和除草剂抗性基因Bar整合到烟草质体基因组中，实现了重组酶基因在植物体胞质内的瞬时表达并诱导重组反应的进行。近来，结合Cre/lox系统删除功能和phiC31重组系统的单向整合功能，De Paepe等发展了一种可重复位点整合系统（Iterative site-specific integration system，ISSI），利用该系统可以实现多个目标基因顺次整合到基因组上同一位点，达到基因聚合（Gene stacking）的目的[18]。
2.2 噬菌體phiC31重组系统介导的基因删除
植物遗传转化过程中，筛选标记基因是为了筛选到稳定转化的转基因植株而插入到质粒载体中的一段编码对某种抗生素、除草剂具有抗性的基因序列。转基因植株中含有筛选标记基因可能会给环境带来生态风险以及引发食品安全问题[19]。同时为了获得具有多个优良性状的转基因植株，通常需要进行多次转化，每一个目的基因的导入都与一个筛选标记基因连锁，操作过程中不仅受到标记基因数量的限制，而且随着筛选基因在基因组中的不断堆积会加大基因沉默的几率，为此有必要对转基因植物所携带的筛选标记基因进行删除。
目前，常见删除筛选标记基因的方法主要有以下3种：①利用Ac/Ds转座子系统实现标记基因删除[20]；②将标记基因和目的基因以共转化的途径导入受体植株中，经过后代的基因分离获得无筛选标记基因的转基因植株[21]；③利用位点重组系统删除筛选标记基因[22]。Cre/loxP位点重组酶系统在无筛选标记基因的转基因作物中应用最为广泛[23]。但由于生物基因组中往往具有假lox位点，在Cre重组酶存在的情况下会导致重复序列间基因组的缺失、重排[24]；另外，由于Cre酶存在的情况下可诱导反应的逆向进行，即删除与整合反应同时进行；同时删除不彻底现象会导致产生嵌合体现象[25]。近年来，phiC31重组系统也被广泛应用于植物质体、细胞核目的基因的删除。Kittiwongwattana等利用phiC31重组酶系统，成功将位于烟草叶绿体基因组中的筛选标记基因删除[26]。先将位于同向排列的attP、attB识别位点之间的壮观霉素抗性基因aadA通过基因枪转化插入烟草叶绿体基因组，随后表达phiC31重组酶基因的质粒载体采用农杆菌介导的2次转化导入上述植株，在获得的32株独立的转基因植株中，29株转基因植株中的筛选标记基因aadA被完全删除，3株表现为删除不完全，而删除不彻底的原因可能是这些植株中相应的phiC31重组酶表达量太低所导致。 phiC31重组酶的删除功能除了可被用于删除位于重组位点间筛选标记基因以外，还可以用来删除阻碍基因表达的片段，从而启动下游目的基因的表达。Thomson等将760 bp大小的non-coding stuffer序列置于2个同向排列的attP、attB位点之间，形成attP-non-coding stuffer-attB结构，该结构上游为一个35S启动子，下游为gusA基因编码区域[27]。该载体转化拟南芥后gusA基因不表达。通过2次转化或杂交导入phiC31重组酶基因，attP、attB位点之间的non-coding stuffer序列被删除，激活了下游gusA基因的表达。Kapusi等用类似的方法，将GFP基因及下游的终止子置于同向排列的attB，attP位点之间，GFP基因上游为Pact启动子，下游则是GUS基因及终止子[28]。该载体转化大麦后获得正常表达GFP但不表达GUS的转基因植株。该植株与表达phiC31重组酶植株杂交后，位于attB，attP位点之间的GFP-Tnos结构被删除，激活了下游GUS基因的表达，杂交F1代删除效率达到25%。对196株自交F2代进行PCR检测，其中139株具有重组删除位点（70%），基本符合杂合子的分离比例，即重组位点会随着植株的有性繁殖稳定遗传到下一代。
利用phiC31重组酶介导的基因删除，也可实现目的基因等位基因的构建。Gils等首先利用phiC31重组系统结合内含肽介导的蛋白结构和功能重建在拟南芥中构建了“双组分”雄性不育系统[29]。将Barnase和ALS基因拆分为无活性的N和C端多肽后分别与来自集胞藻的DnaB和DnaE内含肽N端和C端融合获得Bar-N：：DnaB-N、DnaB-C：：Bar-C、ALS-N：：DnaE-N和DnaE-C：：ALS -C 4个融合基因。植物表达载体上同向排列重组位点attP1-attB1-attB2-attP2。将Bar-N：：DnaB-N和ALS-N：：DnaE-N表达盒置于attP1-attB1之间；DnaB-C：：Bar-C和DnaE-C：：ALS-C表达盒置于attB2-attP2之间。该植物表达载体转化拟南芥后，在内含子的剪切作用下重建完整的不育基因barnase以及除草剂抗性基因ALS，获得的转基因拟南芥为雄性不育并抗除草剂。而表达重组酶phiC31的植株与其杂交后会发生attP-attB位点之间的重组删除反应。发生在attP1与attB1 或attB2之间的删除会产生含DnaB-C：：Bar-C和DnaE-C：：ALS -C表达盒的A1系；发生在attP2与attB1或attB2之间的删除会产生含Bar-N：：DnaB-N和ALS-N：：DnaE-N表达盒的A2系。产生的A1系和A2系中的转基因元件位于染色体上同一位置，为等位基因。分别自交后获得可育纯系A1A1和A2A2。而两者杂交后获得的A1A2在内含肽的反式剪切下生成完整的barnase和ALS，表现雄性不育和抗除草剂。将A1A2不育系作为母本与非转基因植株杂交，A1和A2等位基因发生分离，因此F1代均为可育植株。随后，Kempe等在单子叶植物小麦中也实现了两个目标基因互为等位基因的构建[30]。
2.3 噬菌体phiC31重组系统介导的基因倒位
phiC31重组酶系统中，当重组识别位点attP、attB位于同一染色体上，并反向排列时，重组酶可介导位于识别位点之间的基因序列发生倒位。将控制乳糖操纵子原件lacZpo的启动子Plac与λ噬菌体终止子nutL位点串联置于反向排列的重组位点attP和attB之间，将galK目的基因与一个强终止子和N基因连锁，由于插入方向与启动子方向相反，在没有重组酶参与的环境下目的基因处于“关闭”的状态；而将携带有热敏系统调控的重组酶基因phiC31的噬菌体侵染含上述质粒大肠杆菌D1210（cI857Int-xis+）获得溶源性细菌，42 ℃热激处理后的菌体中检测到galK基因的大量表达，即在大肠杆菌内重组酶基因的瞬时表达诱导了位点间启动子的倒位，目的基因“打開”[31]。除了将启动子位于重组位点之间控制目标基因的表达外，还可以通过固定启动子方向而将目的基因插入反向排列的重组位点间，重组酶诱导下使结合位点间的目的基因序列发生倒位[32]。
Thomson等在真核生物酵母细胞中验证了phiC31重组系统的倒位功能，通过对Cre、CinH、ParA、Tn1727、Tn5053、phiC31、TP9011、Bxb1和U153等重组系统倒位效率的比较，发现phiC31重组酶介导下的基因倒位效率为100%，而Cre重组酶诱导的倒位效率仅为phiC31重组酶诱导的1/2，产生这种现象是因为Cre诱导的重组反应是可逆的[33]。2008年，Rubtsova等在小麦中验证了phiC31重组系统介导的DNA序列倒位功能[34]。将一个与小麦wheat dwarf virus （WDV）病毒复制相关的元件Rep5’置于反向排列的attB和attP识别位点之间，phiC31重组酶介导的Rep5’倒位激活了WDV病毒的复制功能，导致报告基因GFP的表达。
3 小结与展望
在众多的重组酶系统中，phiC31重组酶系统介导重组反应的精确性、高效性以及稳定性的特点为其在植物基因工程研究中的广泛应用提供了良好的前景。从目前的研究成果来看，phiC31重组酶系统介导的基因整合及基因删除功能已在多种植物中得到验证，而其介导的基因倒位功能在植物基因工程操作中还鲜有报道。因此，利用phiC31重组酶介导的倒位功能设计“基因开关”，phiC31重组酶系统与其他类型重组系统相结合，实现农作物外源基因的精确调控将是未来的重点研究方向之一。
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根据重组酶氨基酸的同源性以及催化产物的生化特性，重组酶分为酪氨酸重组酶（tyrosine recombinase）和丝氨酸重组酶（serine recombinase）2大类。其中，酪氨酸重组酶又称为“λ重组酶”家族，在酪氨酸重组酶的催化结构域中，都有一个保守的酪氨酸残基负责攻击核苷酸骨架结构，出现单链断裂切口，产生5-OH末端和3-磷酸基-络氨酸的切割中间体，类似于同源重组中产生的Holliday模型[6]。Cre/lox和FLP/frt重组酶系统是该家族中具有代表性的2个成员。丝氨酸重组酶具有更为保守的催化结构域，其近N端为活性区域，包含一个丝氨酸，该丝氨酸残基攻击DNA骨架使其交错切割，形成3-OH的双链断裂末端，而5-磷酸基与重组酶共价键连接形成联会中间体，随后发生翻转再重新连接，该重组过程类似于双链断裂重组模型（double-stand breakage）[7]。文中主要介绍的phiC31重组系统即是来源于该类家族中分子量较大的大型丝氨酸重组酶的亚家族[8]。
1 噬菌体phiC31重组酶重组特点
噬菌体phiC31重组酶由613个氨基酸构成，能够识别来自噬菌体自身的attP（39 bp）位点和来自细菌基因组的attB（34 bp）位点。attP和attB识别位点均具有7 bp的核心序列（crossover site）及位于其核心序列两侧7 bp的反向重复序列（inverted repeats）（attP中称C、C′，attB中称B、B′）。其中的attP位点还包含臂型结合位点（arm-type sites，分别为P1、P2、P′1、P′2和P′3）。重组过程中，上述结合位点均参与phiC31重组酶的结合。此外，还包括3个宿主因子（Integration host factor，IHF；分别为H1、H2和H′）、3个解离酶（excisionase， Xis）结合位点以及1个辅助因子（factor for invertion stimulation， Fis）结合位点[9]。上述复杂的phiC31重组酶识别序列组成，保证了phiC31重组酶介导重组反应的精确进行。在Cre/lox系统和FLP/frt系统中，重组酶识别位点除了核心序列（8 bp）和两侧完全对称的反向重复序列外，没有其他任何辅助因子的结合位点，且重组反应发生前后识别位点基因序列不会发生改变，由于生物体内时刻进行着分子间的相互作用，在相应重组酶存在的条件下，重组反应会向着删除和整合2个方向同时进行，即Cre/lox系统和FLP/frt系统所诱导的重组反应是可逆的。通过对Cre/lox系统中识别位点的改造，Albert等设计了缩短的loxP位点，有效降低了逆向重组反应的进行，但同时其正向重组效率也被大大降低[10]。而phiC31重组酶体系，不仅对酶底物DNA的核心序列同源性要求十分严格，且识别位点attP与attB自身即为结构具有差异的结合位点，重组发生后产生phiC31重组酶不能识别的attR和attL序列，从而严格控制重组反应的单方向进行[11]。 2 噬菌体phiC31重组酶系统在植物转基因中的应用
2.1 噬菌体phiC31重组酶介导的基因定点整合
从20世纪80年代以来，人类成功实现外源目的基因导入植物细胞基因组中并稳定表达后，转基因技术被广泛应用于农产品的商业化生产，在世界范围25个国家生产出13 400万t的转基因农产品[12]。研究表明，外源基因的插入位点会影响目的基因表达的水平以及表达的稳定性，即所谓的位置效应。因此研究者在如何将外源基因精确导入宿主细胞基因组中以及解决基因沉默等问题上进行了深入的探索与研究。在植物基因工程操作中，利用位点重组酶系统可实现外源基因的精确、单拷贝的插入[10]。
目前，基于重组酶介导的特定位点间的重组反应已经被广泛应用在外源DNA整合到哺乳动物细胞、酵母细胞和高等植物细胞核基因组中[13-14]。Vergunst等最早利用Cre/lox重组酶系统，实现了将T-DNA整合到拟南芥染色体上预期位置。首先获得一个35S-loxP-Cre目标转基因植株（Target line），该植株表达Cre重组酶。随后2次转化的整合载体T-DNA含一个loxP –NPTII- loxP结构，在Cre重组酶参与下发生位点间的重组，整合载体中的loxP-NPTII- loxP替换位于Target line中35S启动子下游的Cre基因表达盒，NPTII基因上游获得35S启动子而得到表达，成功整合的个体获得对卡拉霉素的抗性[15]。然而，基于Target line 上单一的识别位点的基因整合将导致2次转化载体上的非目标序列的同时整合。Louwerse 等利用loxP和改造的lox5171识别位点，在Cre重组酶的参与下实现两位点间表达盒的交换，即RMCE（recombinase-mediated cassette exchage）[16]。将Bar基因表达盒置于2个反向排列的loxP和lox5171位点之间，并置于35S启动子的下游转化拟南芥后获得Target line。上游缺少启动子的NPTII编码框被同样置于2个反向排列的loxP和lox5171位点之间2次转化Target line，Cre介导RMCE后，NPTII基因取代Target line中的Bar基因，在含有卡那霉素的培养基上，盒交换发生的植株将被优先筛选，从而在拟南芥中实现稳定的RMCE。
相对上述Cre/lox重组系统，phiC31重组酶系统具有的单向重组特点，在基因定点整合和RMCE中的应用具有更好的前景。Lutz等将phiC31重组酶系统与Cre/lox重组酶系统相结合将目标基因精确整合到烟草叶绿体基因组中[17]。在该项研究中，首先将一个attB位点以及位于loxP位点之间的壮观霉素抗性基因aadA通过基因枪转化方法导入烟草叶绿体，然后将Cre重组酶基因通过农杆菌转化法导入上述植株，Cre重组酶表达后，删除了位于loxP位点间的aadA标记基因，获得叶绿体基因组不含aadA筛选标记基因的但具有attB/loxP位点的转基因植株。利用农杆菌介导的转化法，该植株随后被导入重组酶phiC31基因。构建含有attP位点并与卡那霉素抗性基因neo连锁质粒载体，基因枪转化法导入上述植株。结果从转化的45个叶片中获得237株对卡那霉素具有抗性的独立株系；对其中113株进行检测，在81株中检测到与attP位点连锁的neo基因被整合到受体植株叶绿体基因组的attB位点处，整合效率大约为72%。另外，在烟草细胞中的瞬时表达phiC31重组酶，也成功将壮观霉素抗性基因aadA和除草剂抗性基因Bar整合到烟草质体基因组中，实现了重组酶基因在植物体胞质内的瞬时表达并诱导重组反应的进行。近来，结合Cre/lox系统删除功能和phiC31重组系统的单向整合功能，De Paepe等发展了一种可重复位点整合系统（Iterative site-specific integration system，ISSI），利用该系统可以实现多个目标基因顺次整合到基因组上同一位点，达到基因聚合（Gene stacking）的目的[18]。
2.2 噬菌體phiC31重组系统介导的基因删除
植物遗传转化过程中，筛选标记基因是为了筛选到稳定转化的转基因植株而插入到质粒载体中的一段编码对某种抗生素、除草剂具有抗性的基因序列。转基因植株中含有筛选标记基因可能会给环境带来生态风险以及引发食品安全问题[19]。同时为了获得具有多个优良性状的转基因植株，通常需要进行多次转化，每一个目的基因的导入都与一个筛选标记基因连锁，操作过程中不仅受到标记基因数量的限制，而且随着筛选基因在基因组中的不断堆积会加大基因沉默的几率，为此有必要对转基因植物所携带的筛选标记基因进行删除。
目前，常见删除筛选标记基因的方法主要有以下3种：①利用Ac/Ds转座子系统实现标记基因删除[20]；②将标记基因和目的基因以共转化的途径导入受体植株中，经过后代的基因分离获得无筛选标记基因的转基因植株[21]；③利用位点重组系统删除筛选标记基因[22]。Cre/loxP位点重组酶系统在无筛选标记基因的转基因作物中应用最为广泛[23]。但由于生物基因组中往往具有假lox位点，在Cre重组酶存在的情况下会导致重复序列间基因组的缺失、重排[24]；另外，由于Cre酶存在的情况下可诱导反应的逆向进行，即删除与整合反应同时进行；同时删除不彻底现象会导致产生嵌合体现象[25]。近年来，phiC31重组系统也被广泛应用于植物质体、细胞核目的基因的删除。Kittiwongwattana等利用phiC31重组酶系统，成功将位于烟草叶绿体基因组中的筛选标记基因删除[26]。先将位于同向排列的attP、attB识别位点之间的壮观霉素抗性基因aadA通过基因枪转化插入烟草叶绿体基因组，随后表达phiC31重组酶基因的质粒载体采用农杆菌介导的2次转化导入上述植株，在获得的32株独立的转基因植株中，29株转基因植株中的筛选标记基因aadA被完全删除，3株表现为删除不完全，而删除不彻底的原因可能是这些植株中相应的phiC31重组酶表达量太低所导致。 phiC31重组酶的删除功能除了可被用于删除位于重组位点间筛选标记基因以外，还可以用来删除阻碍基因表达的片段，从而启动下游目的基因的表达。Thomson等将760 bp大小的non-coding stuffer序列置于2个同向排列的attP、attB位点之间，形成attP-non-coding stuffer-attB结构，该结构上游为一个35S启动子，下游为gusA基因编码区域[27]。该载体转化拟南芥后gusA基因不表达。通过2次转化或杂交导入phiC31重组酶基因，attP、attB位点之间的non-coding stuffer序列被删除，激活了下游gusA基因的表达。Kapusi等用类似的方法，将GFP基因及下游的终止子置于同向排列的attB，attP位点之间，GFP基因上游为Pact启动子，下游则是GUS基因及终止子[28]。该载体转化大麦后获得正常表达GFP但不表达GUS的转基因植株。该植株与表达phiC31重组酶植株杂交后，位于attB，attP位点之间的GFP-Tnos结构被删除，激活了下游GUS基因的表达，杂交F1代删除效率达到25%。对196株自交F2代进行PCR检测，其中139株具有重组删除位点（70%），基本符合杂合子的分离比例，即重组位点会随着植株的有性繁殖稳定遗传到下一代。
利用phiC31重组酶介导的基因删除，也可实现目的基因等位基因的构建。Gils等首先利用phiC31重组系统结合内含肽介导的蛋白结构和功能重建在拟南芥中构建了“双组分”雄性不育系统[29]。将Barnase和ALS基因拆分为无活性的N和C端多肽后分别与来自集胞藻的DnaB和DnaE内含肽N端和C端融合获得Bar-N：：DnaB-N、DnaB-C：：Bar-C、ALS-N：：DnaE-N和DnaE-C：：ALS -C 4个融合基因。植物表达载体上同向排列重组位点attP1-attB1-attB2-attP2。将Bar-N：：DnaB-N和ALS-N：：DnaE-N表达盒置于attP1-attB1之间；DnaB-C：：Bar-C和DnaE-C：：ALS-C表达盒置于attB2-attP2之间。该植物表达载体转化拟南芥后，在内含子的剪切作用下重建完整的不育基因barnase以及除草剂抗性基因ALS，获得的转基因拟南芥为雄性不育并抗除草剂。而表达重组酶phiC31的植株与其杂交后会发生attP-attB位点之间的重组删除反应。发生在attP1与attB1 或attB2之间的删除会产生含DnaB-C：：Bar-C和DnaE-C：：ALS -C表达盒的A1系；发生在attP2与attB1或attB2之间的删除会产生含Bar-N：：DnaB-N和ALS-N：：DnaE-N表达盒的A2系。产生的A1系和A2系中的转基因元件位于染色体上同一位置，为等位基因。分别自交后获得可育纯系A1A1和A2A2。而两者杂交后获得的A1A2在内含肽的反式剪切下生成完整的barnase和ALS，表现雄性不育和抗除草剂。将A1A2不育系作为母本与非转基因植株杂交，A1和A2等位基因发生分离，因此F1代均为可育植株。随后，Kempe等在单子叶植物小麦中也实现了两个目标基因互为等位基因的构建[30]。
2.3 噬菌体phiC31重组系统介导的基因倒位
phiC31重组酶系统中，当重组识别位点attP、attB位于同一染色体上，并反向排列时，重组酶可介导位于识别位点之间的基因序列发生倒位。将控制乳糖操纵子原件lacZpo的启动子Plac与λ噬菌体终止子nutL位点串联置于反向排列的重组位点attP和attB之间，将galK目的基因与一个强终止子和N基因连锁，由于插入方向与启动子方向相反，在没有重组酶参与的环境下目的基因处于“关闭”的状态；而将携带有热敏系统调控的重组酶基因phiC31的噬菌体侵染含上述质粒大肠杆菌D1210（cI857Int-xis+）获得溶源性细菌，42 ℃热激处理后的菌体中检测到galK基因的大量表达，即在大肠杆菌内重组酶基因的瞬时表达诱导了位点间启动子的倒位，目的基因“打開”[31]。除了将启动子位于重组位点之间控制目标基因的表达外，还可以通过固定启动子方向而将目的基因插入反向排列的重组位点间，重组酶诱导下使结合位点间的目的基因序列发生倒位[32]。
Thomson等在真核生物酵母细胞中验证了phiC31重组系统的倒位功能，通过对Cre、CinH、ParA、Tn1727、Tn5053、phiC31、TP9011、Bxb1和U153等重组系统倒位效率的比较，发现phiC31重组酶介导下的基因倒位效率为100%，而Cre重组酶诱导的倒位效率仅为phiC31重组酶诱导的1/2，产生这种现象是因为Cre诱导的重组反应是可逆的[33]。2008年，Rubtsova等在小麦中验证了phiC31重组系统介导的DNA序列倒位功能[34]。将一个与小麦wheat dwarf virus （WDV）病毒复制相关的元件Rep5’置于反向排列的attB和attP识别位点之间，phiC31重组酶介导的Rep5’倒位激活了WDV病毒的复制功能，导致报告基因GFP的表达。
3 小结与展望
在众多的重组酶系统中，phiC31重组酶系统介导重组反应的精确性、高效性以及稳定性的特点为其在植物基因工程研究中的广泛应用提供了良好的前景。从目前的研究成果来看，phiC31重组酶系统介导的基因整合及基因删除功能已在多种植物中得到验证，而其介导的基因倒位功能在植物基因工程操作中还鲜有报道。因此，利用phiC31重组酶介导的倒位功能设计“基因开关”，phiC31重组酶系统与其他类型重组系统相结合，实现农作物外源基因的精确调控将是未来的重点研究方向之一。
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