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该专利涉及一种催化反应与分离过程耦合制备生物柴油的工艺，具体步骤为：（1）油脂的水解反应。在催化剂固定化脂肪酶存在下，原料油脂进行水解反应。（2）甘油的分离纯化。将水解反应得到的自由脂肪酸和甘油从反应体系中分离。（3）脂肪酸的酯化反应。在固定化脂肪酶的作用下，脂肪酸与C1-4的低碳醇发生酯化反应生成生物柴油。