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[摘要] 目的 研究三叶青提取物对α-异硫氰酸萘酯（ANIT）所致肝损伤小鼠的保护作用。 方法 2017年1月～2018年2月选择60只小鼠并随机分为6组，分别为对照组、联苯双酯阳性药物组、模型组、三叶青提取物低、中、高剂量组[（1.0、2.0、4.0）g/kg]。采用灌胃ANIT的方式复制急性黄疸型肝炎模型，造模48 h后测其血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α的含量；检测肝组织匀浆中SOD、MDA、GSH-Px的水平。 结果 三叶青提取物各剂量组均可显著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高剂量组可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），各劑量组均显著降低MDA含量，中、高剂量组可显著提高SOD活性（P<0.05），而GSH-Px水平无显著变化。结论 三叶青提取物对ANIT所致小鼠肝损伤有一定的保护作用，其保护作用可能与减轻炎症因子产生、促进总胆红素的代谢、降低脂质过氧化程度有关。
[关键词] 三叶青；ANIT；肝损伤；抗氧化
[中图分类号] R969.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）30-0032-04
[Abstract] Objective To study the protective effect of trifolium extract on liver injury induced by α-isothiocyanatoacetate （ANIT） in mice. Methods 60 mice from January 2017 to February 2018 were randomly divided into 6 groups， including control group， bifendate positive drugs group， model group， trifolium extract low， medium and high dose groups[（1.0， 2.0， 4.0） g/kg]. The model of acute jaundice hepatitis was reproduced by intragastric administration of ANIT. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL， and TNF-α in serum were determined 48 h after modeling. The levels of SOD， MDA， and GSH-Px in liver homogenate were measured. Results The levels of TBIL and TNF-α were significantly decreased in each dose group（P<0.05）. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL and TNF-α in serum were decreased in medium and high dose groups（P<0.05）. Each dose group significantly decreased the MDA content. The medium and high dose group could significantly increase SOD activity（P<0.05），while GSH-Px levels did not change significantly. Conclusion Trifolium extract has a protective effect on liver injury induced by ANIT in mice. Its protective effect may be related to the reduction of inflammatory factors， promotion of the total bilirubin metabolism and reduction of the lipid peroxidation degree.
[Key words] Trifolium； ANIT； Liver injury； Antioxidant
急性黄疸型肝炎是各种诱因导致肝细胞肿胀、变性，从而引起胆红素的排泄障碍，进而形成黄疸的肝脏损伤疾病，除了皮肤黄染、低热、食欲不振、尿黄等表征外，还伴有总胆红素、多种转氨酶等临床生化指标的升高[1]。中医对黄疸型肝炎的治疗具有悠久的历史，多以清热解毒、利湿退黄、活血化瘀、疏利肝胆论治[2]，能够一定程度地缓解患者细胆管的淤胆和胆栓的形成，从而清除患者体内的集聚胆汁[3]。
三叶青是我国特有珍稀植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的块根，具有清热解毒、防癌护肝等多种功效，常用于高热惊厥、肝炎、风湿、肺炎、痈疔疮疖等症[4]。有研究报道，三叶青具有良好的保肝降酶及抗肝纤维化作用[5]，三叶青多糖对CCl4所致的急性肝损伤具有量效依赖的阻抗作用[6]，前期本课题组的研究表明，三叶青提取物能诱导人肝内胆管癌HCCC-9810细胞凋亡[7]。本文利用α-异硫氰酸萘酯（ANIT）所致小鼠肝损伤模型，探讨其对急性黄疸型肝炎的潜在功效，为其临床应用提供药理学依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
2017年1月～2018年2月期间，60只昆明种雄性SPF级小鼠，体重（18±3）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。每日12 h照明，保持环境温、湿度分别为（25±2）℃、（55±5）%。 1.2 方法
1.2.1 主要试剂 异硫氰酸萘酯（ANIT）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；联苯双酯滴丸购自浙江医药股份有限公司新昌制药厂；胆汁酸（TBA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）检测试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD），考马斯亮蓝试剂盒、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒均购自宁波航景生物科技有限公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒购自碧云天生物科技公司。
1.2.2 药品制备 称取干燥三叶青药材粉末10 g，用200 mL 80%乙醇加热回流提取3次，每次45 min，合并提取液，减压旋转浓缩至50 mL，小鼠灌胃量20、10、5 mL/kg则分别制得高、中、低剂量（按生药计为4.0、2.0、1.0 g/kg）。给药剂量参考成人临床常规用量确定。
1.2.3 动物分组与给药 60只小鼠按每组10只随机分为6组，分别为对照组、模型组、联苯双酯阳性药物组，低、中、高剂量（1.0、2.0、4.0 g/kg）组。连续给药10 d，对照组和模型组灌胃生理盐水，阳性药物组给予联苯双酯溶液（0.15 g/kg），低、中、高剂量组分别给予相应浓度的提取物，第8天给药1 h后造模，对照组给予花生油灌胃15 mL/kg，其他各组小鼠灌胃100 mg/kg ANIT（用花生油75 mL溶解0.5 g ANIT制得），灌胃前、后分别禁食16 h、4 h。
1.3 检测指标测定
造模48 h后小鼠眼静脉丛取血，采血前禁食12 h，全血在4℃，5000 r/min，离心5 min，取上层血清置4℃贮存备用，检测血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量。取血后处死小鼠并迅速分离肝脏，取相同部位的肝组织，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下比较各组病理组织的形态学变化差异；并采用比色法检测肝组织匀浆中SOD，MDA、GSH-Px的活性/含量。
1.4 统计学处理
采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，多组间采用One-way ANOVA方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三叶青提取物对ANIT致肝脏病理组织学变化的影响
如封三图2所示，HE染色可见正常组小鼠肝脏组织细胞形态正常，肝索及肝血窦排列规则，无炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构模糊，大量肝细胞扩张并含有大量红细胞游积，脂滴空泡，可见点状坏死。联苯双酯阳性药组和各给药组均能不同程度地减轻肝脏受损程度。肝小叶结构基本正常，肝窦结构较清晰，肝索基本呈放射状排布，镜下虽可见少量炎性细胞浸润，但与模型组相比有明显改善。
2.2 三叶青提取物对肝损伤小鼠血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量的影响
模型组小鼠肝功能和TNF-α 5项指标的水平均较正常对照组显著增加（P<0.05），表明造模成功。联苯双酯阳性药物组ALT、TBIL、TNF-α 3项指标水平较模型组均显著下降（P<0.05），AST、TBA水平无显著变化；低剂量组（1 g/kg）的TBIL和TNF-α水平显著下降；中、高剂量组（2、4 g/kg）均可使血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α水平顯著下降（P<0.05）。见表1。
2.3 三叶青提取物对ANIT致肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSH-Px活性的影响
从表2结果可知，模型组SOD、GSH-Px 2项指标的活性均较对照组显著降低（P<0.05），而MDA含量较对照组显著升高（P<0.05）。联苯双酯阳性药物组SOD、GSH-Px 2项指标的活性均较模型组显著升高（P<0.05），而MDA含量较模型组显著下降（P<0.05）；三叶青高剂量组（4 g/kg）可显著提高SOD活性，并显著降低MDA含量，低、中剂量组（1、2 g/kg）均可显著降低MDA含量（P<0.05），GSH-Px 水平无显著变化。见表2。
3 讨论
异硫氰酸萘酯（ANIT）致小鼠肝损伤是常用的急性黄疸型肝炎模型。ANIT进入体内后，先发生胆管周围微环境的改变，巨噬细胞和树突状细胞受刺激后触发免疫作用[8]，肝中出现上皮增生，并损伤胆管上皮细胞，使胆汁淤积、胆管阻塞，引起肝内胆管增生及周围炎症，从而导致高胆红素血症和胆汁分泌减少，最终产生肝脏毒性[9]。
丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）是主要分布在肝细胞质内的可溶性酶，肝脏受损后肝细胞中的转氨酶便释放入血，血清中ALT和AST水平高低常作为判定肝损伤程度的重要指标。丙二醛（MDA）是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应产生的代谢终产物，具有细胞毒性，其含量可反映体内氧自由基生成量及活性，从而间接反映机体和细胞的受损程度[10]。过多的活性氧攻击肝细胞膜而致脂质过氧化反应，同时耗竭肝细胞内重要的抗氧化酶[11]，SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）均是机体主要的氧自由基清除酶，是肝、肺等多种组织重要的抗氧化防御因子[12]，能够清除活性氧自由基及其诱发的脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性。由肝巨噬细胞分泌的TNF-α是一种重要的促炎因子和免疫调节因子[13]，通过诱导肝细胞凋亡和其他炎症因子的生成，引起肝小叶受损，ALT和AST水平明显升高，促进细胞内中性粒细胞浸润，增加氧自由基的释放，还可诱导IL-1、IL-8等细胞因子释放[14]，破坏机体的免疫平衡，是参与各种肝脏疾病发生与发展的关键因子[15，16]。
黄疸型肝炎病程长，部分病例退黄较难。病因从西医角度多为胆红素生成过多、肝细胞功能较低、胆汁瘀积等，多采用肾上腺皮质激素等治疗，而长期应用激素会发生多种严重的副作用，且临床应用的禁忌证较多。中医角度认为黄疸型肝炎为“湿、热、毒、瘀”引起的浑浊阻滞，肝胆功能失调引起的肝胆病症。近年来中医药在治疗黄疸型肝炎方面的临床报道日趋增多，主要涉及清热、祛湿、泻下、补虚、理气、解表6大类[17]，以清热解毒，利湿化痰，退黄保肝之法为主[18]。如茵陈蒿汤、茵栀黄颗粒、酢浆草白茅根煎剂等[19]，中医治疗黄疸虽有明显疗效和特色，然而目前的研究多为临床疗效观察，对药物作用机制的研究尚不清晰。三叶青具有清热解毒、祛湿化痰、活血止痛等传统功效，民间用于抗小儿高热、黄疸型肝炎、脑膜炎等[20]，可充分发挥其调节免疫、抗病毒、促进肝脏修复的作用，然而其作用机制尚缺乏现代药理学实验研究。从本研究结果可知，三叶青提取物各剂量组均可显著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高剂量组可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），并且降低水平存在一定的量效关系。表明其可通过减轻炎症因子产生，促进总胆红素的代谢，减少胆汁酸（TBA）的积累而减轻肝细胞受损和坏死的程度[21]。另一方面，三叶青各剂量组均显著降低MDA含量，中、高剂量组可显著提高SOD活性，而GSH-Px水平无显著变化，表明其可以通过提高肝细胞中抗氧化酶活性，抑制肝细胞发生脂质过氧化等来改善肝损伤情况。 本研究结果为三叶青保肝作用的进一步开发利用提供了相关实验依据，综合运用中西医不同的退黄措施并促使其互为补充以提高疗效的临床研究，有待更进一步的深入研究。
[参考文献]
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（收稿日期：2018-03-30）
[关键词] 三叶青；ANIT；肝损伤；抗氧化
[中图分类号] R969.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）30-0032-04
[Abstract] Objective To study the protective effect of trifolium extract on liver injury induced by α-isothiocyanatoacetate （ANIT） in mice. Methods 60 mice from January 2017 to February 2018 were randomly divided into 6 groups， including control group， bifendate positive drugs group， model group， trifolium extract low， medium and high dose groups[（1.0， 2.0， 4.0） g/kg]. The model of acute jaundice hepatitis was reproduced by intragastric administration of ANIT. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL， and TNF-α in serum were determined 48 h after modeling. The levels of SOD， MDA， and GSH-Px in liver homogenate were measured. Results The levels of TBIL and TNF-α were significantly decreased in each dose group（P<0.05）. The levels of ALT， AST， TBA， TBIL and TNF-α in serum were decreased in medium and high dose groups（P<0.05）. Each dose group significantly decreased the MDA content. The medium and high dose group could significantly increase SOD activity（P<0.05），while GSH-Px levels did not change significantly. Conclusion Trifolium extract has a protective effect on liver injury induced by ANIT in mice. Its protective effect may be related to the reduction of inflammatory factors， promotion of the total bilirubin metabolism and reduction of the lipid peroxidation degree.
[Key words] Trifolium； ANIT； Liver injury； Antioxidant
急性黄疸型肝炎是各种诱因导致肝细胞肿胀、变性，从而引起胆红素的排泄障碍，进而形成黄疸的肝脏损伤疾病，除了皮肤黄染、低热、食欲不振、尿黄等表征外，还伴有总胆红素、多种转氨酶等临床生化指标的升高[1]。中医对黄疸型肝炎的治疗具有悠久的历史，多以清热解毒、利湿退黄、活血化瘀、疏利肝胆论治[2]，能够一定程度地缓解患者细胆管的淤胆和胆栓的形成，从而清除患者体内的集聚胆汁[3]。
三叶青是我国特有珍稀植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）的块根，具有清热解毒、防癌护肝等多种功效，常用于高热惊厥、肝炎、风湿、肺炎、痈疔疮疖等症[4]。有研究报道，三叶青具有良好的保肝降酶及抗肝纤维化作用[5]，三叶青多糖对CCl4所致的急性肝损伤具有量效依赖的阻抗作用[6]，前期本课题组的研究表明，三叶青提取物能诱导人肝内胆管癌HCCC-9810细胞凋亡[7]。本文利用α-异硫氰酸萘酯（ANIT）所致小鼠肝损伤模型，探讨其对急性黄疸型肝炎的潜在功效，为其临床应用提供药理学依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
2017年1月～2018年2月期间，60只昆明种雄性SPF级小鼠，体重（18±3）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。每日12 h照明，保持环境温、湿度分别为（25±2）℃、（55±5）%。 1.2 方法
1.2.1 主要试剂 异硫氰酸萘酯（ANIT）购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；联苯双酯滴丸购自浙江医药股份有限公司新昌制药厂；胆汁酸（TBA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）检测试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD），考马斯亮蓝试剂盒、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒均购自宁波航景生物科技有限公司；肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒购自碧云天生物科技公司。
1.2.2 药品制备 称取干燥三叶青药材粉末10 g，用200 mL 80%乙醇加热回流提取3次，每次45 min，合并提取液，减压旋转浓缩至50 mL，小鼠灌胃量20、10、5 mL/kg则分别制得高、中、低剂量（按生药计为4.0、2.0、1.0 g/kg）。给药剂量参考成人临床常规用量确定。
1.2.3 动物分组与给药 60只小鼠按每组10只随机分为6组，分别为对照组、模型组、联苯双酯阳性药物组，低、中、高剂量（1.0、2.0、4.0 g/kg）组。连续给药10 d，对照组和模型组灌胃生理盐水，阳性药物组给予联苯双酯溶液（0.15 g/kg），低、中、高剂量组分别给予相应浓度的提取物，第8天给药1 h后造模，对照组给予花生油灌胃15 mL/kg，其他各组小鼠灌胃100 mg/kg ANIT（用花生油75 mL溶解0.5 g ANIT制得），灌胃前、后分别禁食16 h、4 h。
1.3 检测指标测定
造模48 h后小鼠眼静脉丛取血，采血前禁食12 h，全血在4℃，5000 r/min，离心5 min，取上层血清置4℃贮存备用，检测血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量。取血后处死小鼠并迅速分离肝脏，取相同部位的肝组织，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色，显微镜下比较各组病理组织的形态学变化差异；并采用比色法检测肝组织匀浆中SOD，MDA、GSH-Px的活性/含量。
1.4 统计学处理
采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，多组间采用One-way ANOVA方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三叶青提取物对ANIT致肝脏病理组织学变化的影响
如封三图2所示，HE染色可见正常组小鼠肝脏组织细胞形态正常，肝索及肝血窦排列规则，无炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构模糊，大量肝细胞扩张并含有大量红细胞游积，脂滴空泡，可见点状坏死。联苯双酯阳性药组和各给药组均能不同程度地减轻肝脏受损程度。肝小叶结构基本正常，肝窦结构较清晰，肝索基本呈放射状排布，镜下虽可见少量炎性细胞浸润，但与模型组相比有明显改善。
2.2 三叶青提取物对肝损伤小鼠血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量的影响
模型组小鼠肝功能和TNF-α 5项指标的水平均较正常对照组显著增加（P<0.05），表明造模成功。联苯双酯阳性药物组ALT、TBIL、TNF-α 3项指标水平较模型组均显著下降（P<0.05），AST、TBA水平无显著变化；低剂量组（1 g/kg）的TBIL和TNF-α水平显著下降；中、高剂量组（2、4 g/kg）均可使血清ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α水平顯著下降（P<0.05）。见表1。
2.3 三叶青提取物对ANIT致肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSH-Px活性的影响
从表2结果可知，模型组SOD、GSH-Px 2项指标的活性均较对照组显著降低（P<0.05），而MDA含量较对照组显著升高（P<0.05）。联苯双酯阳性药物组SOD、GSH-Px 2项指标的活性均较模型组显著升高（P<0.05），而MDA含量较模型组显著下降（P<0.05）；三叶青高剂量组（4 g/kg）可显著提高SOD活性，并显著降低MDA含量，低、中剂量组（1、2 g/kg）均可显著降低MDA含量（P<0.05），GSH-Px 水平无显著变化。见表2。
3 讨论
异硫氰酸萘酯（ANIT）致小鼠肝损伤是常用的急性黄疸型肝炎模型。ANIT进入体内后，先发生胆管周围微环境的改变，巨噬细胞和树突状细胞受刺激后触发免疫作用[8]，肝中出现上皮增生，并损伤胆管上皮细胞，使胆汁淤积、胆管阻塞，引起肝内胆管增生及周围炎症，从而导致高胆红素血症和胆汁分泌减少，最终产生肝脏毒性[9]。
丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）是主要分布在肝细胞质内的可溶性酶，肝脏受损后肝细胞中的转氨酶便释放入血，血清中ALT和AST水平高低常作为判定肝损伤程度的重要指标。丙二醛（MDA）是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应产生的代谢终产物，具有细胞毒性，其含量可反映体内氧自由基生成量及活性，从而间接反映机体和细胞的受损程度[10]。过多的活性氧攻击肝细胞膜而致脂质过氧化反应，同时耗竭肝细胞内重要的抗氧化酶[11]，SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）均是机体主要的氧自由基清除酶，是肝、肺等多种组织重要的抗氧化防御因子[12]，能够清除活性氧自由基及其诱发的脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性。由肝巨噬细胞分泌的TNF-α是一种重要的促炎因子和免疫调节因子[13]，通过诱导肝细胞凋亡和其他炎症因子的生成，引起肝小叶受损，ALT和AST水平明显升高，促进细胞内中性粒细胞浸润，增加氧自由基的释放，还可诱导IL-1、IL-8等细胞因子释放[14]，破坏机体的免疫平衡，是参与各种肝脏疾病发生与发展的关键因子[15，16]。
黄疸型肝炎病程长，部分病例退黄较难。病因从西医角度多为胆红素生成过多、肝细胞功能较低、胆汁瘀积等，多采用肾上腺皮质激素等治疗，而长期应用激素会发生多种严重的副作用，且临床应用的禁忌证较多。中医角度认为黄疸型肝炎为“湿、热、毒、瘀”引起的浑浊阻滞，肝胆功能失调引起的肝胆病症。近年来中医药在治疗黄疸型肝炎方面的临床报道日趋增多，主要涉及清热、祛湿、泻下、补虚、理气、解表6大类[17]，以清热解毒，利湿化痰，退黄保肝之法为主[18]。如茵陈蒿汤、茵栀黄颗粒、酢浆草白茅根煎剂等[19]，中医治疗黄疸虽有明显疗效和特色，然而目前的研究多为临床疗效观察，对药物作用机制的研究尚不清晰。三叶青具有清热解毒、祛湿化痰、活血止痛等传统功效，民间用于抗小儿高热、黄疸型肝炎、脑膜炎等[20]，可充分发挥其调节免疫、抗病毒、促进肝脏修复的作用，然而其作用机制尚缺乏现代药理学实验研究。从本研究结果可知，三叶青提取物各剂量组均可显著降低TBIL和TNF-α水平（P<0.05），中、高剂量组可以降低血清中ALT、AST、TBA、TBIL、TNF-α含量（P<0.05），并且降低水平存在一定的量效关系。表明其可通过减轻炎症因子产生，促进总胆红素的代谢，减少胆汁酸（TBA）的积累而减轻肝细胞受损和坏死的程度[21]。另一方面，三叶青各剂量组均显著降低MDA含量，中、高剂量组可显著提高SOD活性，而GSH-Px水平无显著变化，表明其可以通过提高肝细胞中抗氧化酶活性，抑制肝细胞发生脂质过氧化等来改善肝损伤情况。 本研究结果为三叶青保肝作用的进一步开发利用提供了相关实验依据，综合运用中西医不同的退黄措施并促使其互为补充以提高疗效的临床研究，有待更进一步的深入研究。
[参考文献]
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（收稿日期：2018-03-30）