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摘要：为了解四川中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征，分离提取土壤微生物DNA，以细菌通用引物PCR扩增，DGGE分离，切割条带、回收并测序，在GenBank中查得菌种。结果表明，中江丹参轮作期间，土壤细菌主要群落包括：Alpha proteobacterium，Sphingomonas sp.，Uncultured bacterium isolate LH2-12，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band h，Uncultured Arthrobacter sp.，Uncultured bacterium isolate DGGE gel band a1-11，Uncultured Sphingomonas sp.。休种1年与当年种植丹参土壤细菌多样性相似，而与休种3年土壤细菌种群结构有明显差异；休种第2年属于过渡。说明中江丹参轮作期休种为其土壤细菌群落遗传多样性逐渐恢复平衡过程；且休地第2年是关键时期，与笔者前期采用培养法及土壤真菌群落结构相关的研究结果一致。
关键词：丹参土壤细菌；PCR-DGGE；遗传多样性；变化特征
中图分类号：S567.5+30.1；S154.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）04-0048-04
收稿日期：2013-08-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：81173493）；国家科技支撑计划（编号：2006BAI09B03-4）。
作者简介：林贵兵（1981—），男，四川自贡人，博士，讲师，研究方向为中药资源可持续利用与药材质量标准化。Tel：（0791）87118997；E-mail：linguibing897@gmail.com。
通信作者：严铸云，博士。E-mail：cdtcmyan@126.com。丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效。在中药材生产质量管理规范（GAP）实施过程中，中药材种植快速发展；但也出现了一些严重的问题，如连作障碍。丹参忌连作，连作导致病虫害严重，其质量和产量明显下降[1]。土壤生物环境恶化是引起作物连作障碍形成的主要机制之一[2]。研究结果表明，土壤微生物群落结构多样性与土传病害、连作障碍有着密切的关系[3]；对地黄[4]、麦冬[5]和苍术[6]研究认为，土壤微生物群落失衡是引起连作障碍的主要因素之一。在前期的研究中，通过纯培养法试验发现，种植丹参的土壤中各类微生物数量与群落结构发生变化，重新建立土壤生态系统平衡；栽培丹参后土壤微生物群落自然恢复间隔至少为2年[7]。前期的研究方法主要是通过培养法研究土壤微生物群落，但此法只能对土壤中的可培养优势微生物进行分析，而土壤中有绝大部分是不可培养微生物，因此培养法不能全面反映其微生物群落。本试验以PCR-DGGE技术研究中江丹参栽培轮作休地期间其土壤细菌群落遗传多样性变化特征，以揭示细菌群落结构在土壤微生物群落平衡自然恢复的变化特征，为丹参栽培地轮作期间土壤退化的修复以及缓解连作障碍提供理论基础。
1材料与方法
1.1供试土壤基本情况
试验区设在四川中江石泉镇范围内，104°35′26″E，30°57′04″N，属中亚热带湿润气候区；年平均气温16.5 ℃，年均降雨量1 200～1 400 mm；地形为台地，地势较平坦，面积 1 km2，土壤属红黄壤，海拔750 m。
2008年3月在试验区范围内，选取丹参休种（现为油菜）1～4年的样地，长宽在20 m×10 m以上；每一休种年选5块样地，丹参休种期间，为油菜-小麦的轮作体系；采用双“S”法采样与四分法取1.0 kg土壤，用牛皮纸袋装好，带回实验室，在4 ℃下保存备用，1月内进行土壤微生物分析。
1.2土壤微生物的解离
取土壤样品2.0 g，加入20 g/L的偏磷酸钠（pH值8.5，含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30），涡旋振荡，离心，去上清液。
1.3土壤微生物DNA提取方法
参照文献[8-11]，略作改良，具体如下：（1）取沉淀于SDS裂解液中涡旋；（2）68 ℃温浴1 h，同时轻轻摇动，12 000 r/min 离心，取上清液体；（3）加入0.125倍体积的 5 mol/L 的醋酸钾和0.42倍的40%的 PEG-8000；在-20 ℃下沉淀约15 min，12 000 r/min离心15 min，去上清液；（4）加入CTAB 提取液中溶解沉淀，68 ℃温浴15 min，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻柔混均匀，12 000 r/min离心10 min；（5）在DNA上清液中加入0.6～1.0倍体积的异丙醇，-20 ℃放置3 h以上，13 000 r/min离心20 min；（6）用70%乙醇洗DNA 2～3次，自然晾干，加无菌水溶解备用。
1.4DNA检测
1.5PCR过程
3讨论
本试验采用PCR-DGGE技术研究土壤细菌群落结构变化特征，结果表明，四川中江丹参种植和休种期间，其土壤细菌群落遗传多样性发生了变化，导致土壤微生物结构发生改变，且在不同的丹参休种年限之间差异明显，特别是在栽培丹参后休种第2年属于过渡阶段，是土壤细菌群落失衡恢复的重要时期。这对采用改良土壤微生态环境以缓解丹参连作障碍有重要的实用指导价值，有利于揭示丹参连作障碍形成关键因素。
PCR-DGGE法研究土壤微生物群落结构具有快速、可重复性等优点，在近几年来研究土壤微生物生态等领域研究上得到广泛应用，克服了传统培养法培养微生物种群局限性的缺点，能对土壤中不可培养的微生物菌群进行研究[16]。但是，本技术依赖于对土壤微生物DNA提取技术和PCR技术，因此DNA提取的土壤微生物菌群的全面性和PCR扩增的引物、扩增条件优化等因素对DGGE分离菌群丰富度具有至关重要的影响。 参考文献：
[1]张辰露，孙群，叶青. 连作对丹参生长的障碍效应[J]. 西北植物学报，2005，25（5）：1029-1034.
[2]张子龙，王文全. 植物连作障碍的形成机制及其调控技术研究进展[J]. 生物学杂志，2010，27（5）：69-72.
[3]郑良永，胡剑非，林昌华，等.作物连作障碍的产生及防治[J]. 热带农业科学，2005，25（2）：58-62.
[4]陈慧，郝慧荣，熊 君，等.地黄连作对根际微生物区系及土壤酶活性的影响[J]. 应用生态学报，2007，18（12）：2755-2759.
[5]李芳琼. 不同连作年限麦冬根际土壤微生物区系动态研究[J]. 土壤通报，2006，37（3）：563-566.
[6]郭兰萍，黄璐琦，蒋有绪，等. 栽培苍术根际土壤微生物变化[J]. 中国中药杂志，2007，32（12）：1131-1133.
[7]林贵兵，万德光，杨新杰，等. 四川中江丹参栽培地轮作期间土壤微生物的变化特点[J]. 中国中药杂志，2009，34（24）：3184-3187.
[8]陈旭玉，周亚奎，余贤美，等. 一种直接用于PCR的土壤微生物DNA提取方法[J]. 中国农学通报，2008，24（4）：33-36.
[9]张瑞福，曹慧，崔中利，等. 土壤微生物总DNA的提取和纯化[J]. 微生物学报，2003，43（2）：276-282.
[10]Yeates C，Gillings M R，Davison A D，et al. Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification[J]. Biological Procedures Online，1998，1（1）：40-46.
[11]徐晓宇，闵航，刘和，等.土壤微生物总DNA提取方法的比较[J]. 农业生物技术学报，2005，13（3）：377-381.
[12]Carter M R. Soil quality for sustainable land management：organic matter and aggregation interactions that maintain soil functions[J]. Agronomy Journal，2002，94：38-47.
[13]Doran J W，Sarrantonio M，Liebig M A. Soil health and sustainability[J]. Advances in Agriculture，1996，56：1-54.
[14]胡元森，吴坤，李翠香，等.黄瓜连作对土壤微生物区系影响Ⅱ. 基于DGGE方法对微生物群落遗传的变化分析[J]. 中国农业科学，2007，4（10）：2267-2273.
[15]李卫东，孟祥文，李伟，等.一种从银染后聚丙烯酰胺凝胶中回收、克隆DNA的方法[J]. 中华医学遗传学杂志，1997，14（6）：58-59.
[16]胡宇容，叶小梅，常志州，等. 沼气池微生物生态群落PCR-DGGE分析方法研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（3）：39-42.
关键词：丹参土壤细菌；PCR-DGGE；遗传多样性；变化特征
中图分类号：S567.5+30.1；S154.3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）04-0048-04
收稿日期：2013-08-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：81173493）；国家科技支撑计划（编号：2006BAI09B03-4）。
作者简介：林贵兵（1981—），男，四川自贡人，博士，讲师，研究方向为中药资源可持续利用与药材质量标准化。Tel：（0791）87118997；E-mail：linguibing897@gmail.com。
通信作者：严铸云，博士。E-mail：cdtcmyan@126.com。丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效。在中药材生产质量管理规范（GAP）实施过程中，中药材种植快速发展；但也出现了一些严重的问题，如连作障碍。丹参忌连作，连作导致病虫害严重，其质量和产量明显下降[1]。土壤生物环境恶化是引起作物连作障碍形成的主要机制之一[2]。研究结果表明，土壤微生物群落结构多样性与土传病害、连作障碍有着密切的关系[3]；对地黄[4]、麦冬[5]和苍术[6]研究认为，土壤微生物群落失衡是引起连作障碍的主要因素之一。在前期的研究中，通过纯培养法试验发现，种植丹参的土壤中各类微生物数量与群落结构发生变化，重新建立土壤生态系统平衡；栽培丹参后土壤微生物群落自然恢复间隔至少为2年[7]。前期的研究方法主要是通过培养法研究土壤微生物群落，但此法只能对土壤中的可培养优势微生物进行分析，而土壤中有绝大部分是不可培养微生物，因此培养法不能全面反映其微生物群落。本试验以PCR-DGGE技术研究中江丹参栽培轮作休地期间其土壤细菌群落遗传多样性变化特征，以揭示细菌群落结构在土壤微生物群落平衡自然恢复的变化特征，为丹参栽培地轮作期间土壤退化的修复以及缓解连作障碍提供理论基础。
1材料与方法
1.1供试土壤基本情况
试验区设在四川中江石泉镇范围内，104°35′26″E，30°57′04″N，属中亚热带湿润气候区；年平均气温16.5 ℃，年均降雨量1 200～1 400 mm；地形为台地，地势较平坦，面积 1 km2，土壤属红黄壤，海拔750 m。
2008年3月在试验区范围内，选取丹参休种（现为油菜）1～4年的样地，长宽在20 m×10 m以上；每一休种年选5块样地，丹参休种期间，为油菜-小麦的轮作体系；采用双“S”法采样与四分法取1.0 kg土壤，用牛皮纸袋装好，带回实验室，在4 ℃下保存备用，1月内进行土壤微生物分析。
1.2土壤微生物的解离
取土壤样品2.0 g，加入20 g/L的偏磷酸钠（pH值8.5，含10 g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30），涡旋振荡，离心，去上清液。
1.3土壤微生物DNA提取方法
参照文献[8-11]，略作改良，具体如下：（1）取沉淀于SDS裂解液中涡旋；（2）68 ℃温浴1 h，同时轻轻摇动，12 000 r/min 离心，取上清液体；（3）加入0.125倍体积的 5 mol/L 的醋酸钾和0.42倍的40%的 PEG-8000；在-20 ℃下沉淀约15 min，12 000 r/min离心15 min，去上清液；（4）加入CTAB 提取液中溶解沉淀，68 ℃温浴15 min，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻柔混均匀，12 000 r/min离心10 min；（5）在DNA上清液中加入0.6～1.0倍体积的异丙醇，-20 ℃放置3 h以上，13 000 r/min离心20 min；（6）用70%乙醇洗DNA 2～3次，自然晾干，加无菌水溶解备用。
1.4DNA检测
1.5PCR过程
3讨论
本试验采用PCR-DGGE技术研究土壤细菌群落结构变化特征，结果表明，四川中江丹参种植和休种期间，其土壤细菌群落遗传多样性发生了变化，导致土壤微生物结构发生改变，且在不同的丹参休种年限之间差异明显，特别是在栽培丹参后休种第2年属于过渡阶段，是土壤细菌群落失衡恢复的重要时期。这对采用改良土壤微生态环境以缓解丹参连作障碍有重要的实用指导价值，有利于揭示丹参连作障碍形成关键因素。
PCR-DGGE法研究土壤微生物群落结构具有快速、可重复性等优点，在近几年来研究土壤微生物生态等领域研究上得到广泛应用，克服了传统培养法培养微生物种群局限性的缺点，能对土壤中不可培养的微生物菌群进行研究[16]。但是，本技术依赖于对土壤微生物DNA提取技术和PCR技术，因此DNA提取的土壤微生物菌群的全面性和PCR扩增的引物、扩增条件优化等因素对DGGE分离菌群丰富度具有至关重要的影响。 参考文献：
[1]张辰露，孙群，叶青. 连作对丹参生长的障碍效应[J]. 西北植物学报，2005，25（5）：1029-1034.
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[3]郑良永，胡剑非，林昌华，等.作物连作障碍的产生及防治[J]. 热带农业科学，2005，25（2）：58-62.
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[6]郭兰萍，黄璐琦，蒋有绪，等. 栽培苍术根际土壤微生物变化[J]. 中国中药杂志，2007，32（12）：1131-1133.
[7]林贵兵，万德光，杨新杰，等. 四川中江丹参栽培地轮作期间土壤微生物的变化特点[J]. 中国中药杂志，2009，34（24）：3184-3187.
[8]陈旭玉，周亚奎，余贤美，等. 一种直接用于PCR的土壤微生物DNA提取方法[J]. 中国农学通报，2008，24（4）：33-36.
[9]张瑞福，曹慧，崔中利，等. 土壤微生物总DNA的提取和纯化[J]. 微生物学报，2003，43（2）：276-282.
[10]Yeates C，Gillings M R，Davison A D，et al. Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification[J]. Biological Procedures Online，1998，1（1）：40-46.
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[15]李卫东，孟祥文，李伟，等.一种从银染后聚丙烯酰胺凝胶中回收、克隆DNA的方法[J]. 中华医学遗传学杂志，1997，14（6）：58-59.
[16]胡宇容，叶小梅，常志州，等. 沼气池微生物生态群落PCR-DGGE分析方法研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（3）：39-42.