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摘 要：实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3 456个克隆，插入片段在40～100kb，平均插入片段55kb，空载率低于5%，覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建，为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。
关键词：链霉菌；BAC文库；基因组
中图分类号 S435.111 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）24-17-03
Construction of the Bacterial Artificial Chromosome Library of Streptomyces JK-1 Resistance to Magnaporthe oryzae
Zhang Xuejiang et al.
（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Diseases，Insect Pests and Weeds Control，Wuhan 430064，China）
Abstract：A genomic bacterial artificial chromosome（BAC）library was constructed using nuclear DNA of Streptomyces JK-1 resistance to Magnaporthe oryzae. The library collected 3 456 recombinant clones carrying inserts with sizes ranging from 40kb to 100kb. The average insert size was about 55kb with empty-vector rate less than 5%. This BAC library represented 17.3 equivalents of Streptomyces genome. The BAC library will help further genome and fucntional gene research.
Key words：Streptomyces；BAC library；Genome
放线菌聚酮合酶基因（polyketide synthase genes，PKSs）合成的聚酮化合物具有广谱生物活性，表现出抗细菌、抗真菌、抗癌、治疗心血管疾病、降低胆固醇等效果[1]。放线菌中最重要的成员链霉菌，其产生的聚酮化合物占人类医用抗生素的60%以上[2]。在过去的几十年里，许多聚酮生物合成途径中的重要基因已被克隆并被异源表达[3-5]。
近年来，本实验室从蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）中分离到一株内生链霉菌JK-1，其次生代谢产物经平板生测实验表明，对稻瘟病菌的抑制率达99%以上。次生代谢产物经质谱分析表明，活性物质属于七烯类化合物，该化合物在化学结构数据库中没有相应的结构，属于一种全新的聚酮化合物。因此本项目试图将本实验室发现的这株链霉菌JK-1基因组中的多烯类聚酮合成酶基因/簇通过构建基因组BAC（Bacterial artificial chromosome）文库的方法克隆出来，并进行生物信息学分析和功能预测，为抗水稻稻瘟病提供新的抗性基因。
1 材料与方法
1.1 实验材料 链霉菌JK-1由本实验室保存，该菌自蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）（于2008年采自中国科学院武汉植物园）内分离得到，其孢子的甘油悬浮液于-80℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 BAC载体的制备 克隆载体pHZAUBAC1[6]由华中农业大学罗美中教授惠赠。pHZAUBAC1质粒采用Qiagen plasmid midi kit提取，用BamHI（NEB）酶切，再用CIAP（NEB）酶脱磷酸化并进行自连反应，用脉冲电泳分离目的DNA片段pIndigoBAC36-S，用电洗脱法回收估测浓度，根据DNA的浓度加入甘油调整终浓度至25ng/μL，分装后于-80℃保存。
1.2.2 高分子量基因组DNA BamHI部分酶切产物的制备 链霉菌JK-1高纯度大分子量基因组DNA凝胶块（plug）的制备参照王万群的实验方法[7]。将制备好的plug做BamHI部分酶切，确定能产生50～150kb范围片段的内切酶用量。设0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8共6个不同用量的BamHI酶浓度梯度，3/8的plug，冰上轻摇2h，然后30℃酶切10min。对酶切产物进行脉冲场凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间0.1～40s，运行16h。根据电泳结果，确定最适内切酶用量。然后做大量酶切，经2次脉冲场电泳、电洗脱法分离纯化50～100kb和100～150kb间的DNA片段的凝胶块，用λDNA来定量所回收大片段DNA的浓度。
1.2.3 BAC文库的构建 回收的大片段DNA与载体按1∶1、5∶1、10∶1的比例进行连接，筛选最佳连接比例。连接产物用30%PEG8000透析，脱盐和浓缩。然后取2μL连接产物转化20μL感受态细胞ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant（Epicentre公司），转化条件：1.25kV/cm，200Ω，25μF。转化产物中加入980μL的SOC培养基，37℃振荡培养1h，涂布LB平板（12.5μg/mL氯霉素、80μg/mL X-gal和100μg/mL IPTG），37℃倒置培养18h，通过蓝白斑筛选，鉴别可能的重组克隆[8]。挑取白色菌落，LB液体培养基37℃ 225r震荡培养18h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切检测插入片段大小和空载率。最后挑取白色克隆到含有70μL冻存培养基的384孔培养板里，37℃培养至培养基液变浑浊，用384针的Replicator将文库复制2份，一并贮存于-80℃低温冰箱保存。 1.2.4 BAC文库的质量分析 从制备好的BAC文库中随机挑取100个克隆，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切，脉冲电泳检测插入片段大小，脉冲条件：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间5～15s，运行15h。计算平均插入片段大小和空载率，估算全基因组覆盖度。
2 结果与分析
2.1 高分子量DNA制备与检测 本研究采用菌丝包埋法制备plug，制备好的plug经酶解释放DNA，蛋白酶K消化处理，脉冲电泳检测表明该方法提取的基因组DNA质量高，片段大，DNA降解少，完全能满足建库需求（图1）。
[M 1 2 3]
图1 链霉菌JK-1 HMW DNA脉冲电泳
注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1、2、3泳道为提取的基因组DNA。脉冲电泳条件：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～50s，16h。
2.2 基因组DNA酶切 酶切后脉冲结果显示，第4道的大部分片段集中在50～150kb，所以1/3的plug所用酶量在1.2U和2.4U最佳（图2）。以此为基础进行大量酶切，回收50～100kb及100～150kb的片段。
[M 1 2 3 4 5 6]
图2 链霉菌JK-1 HMW DNA的BamHI不完全酶切
注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1～6泳道为1/3 plug分别为0，0.3U，0.6U，1.2U，2.4U，3.6U的BamHI于30℃酶切10min的结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，0.1～40s，16h。
2.3 大片段选择回收 本实验用1.2U BamHI对plug进行了大量酶切，然后用脉冲场电泳分离，切下50～150kb的大片段，再分割成50～100kb、100～150kb的2个胶块，进行第2次片段选择。经过2次选择，有效地去除了较小的片段。
2.4 连接与转化 电泳结果显示本实验的载体质量高纯度好。本实验设置了片段与载体1∶1、5∶1、10∶1这3个梯度连接比例。结果显示，在5∶1的比例下，长出的克隆数目明显多于其它连接比例。连接后的产物经偷袭除盐处理以提高转化效率。
2.5 BAC文库质量检测 随机挑取100个克隆，接种到5mL含有12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 240r/min培养12h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，I-SceI酶切检测插入片段的大小。统计结果显示插入判断长度集中于50～100kb，平均大小55kb，文库空载率低于5%（图3）。链霉菌基因组大小约10M。本文库共有3 456个克隆，覆盖了链霉菌JK-1基因组至少17.3倍。
[M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13]
图3 随机挑取13个链霉菌JK-1 BAC克隆的I-SceI酶切片段大小图谱
注：M：Low range PFG Marke（NEB产品），1～13泳道为BAC克隆的I-SceI酶切结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～15s，16h。 （下转129页）
（上接18页）3 讨论
本文所用的BAC载体pCUGIBAC1由pIndigoBAC536和pGEM-4Z 2个载体连接而成，该载体综合了传统BAC载体稳定性好和链霉菌整合型载体的优势，完全满足了本实验的要求。在制备高质量DNA时是将菌丝体先包埋到低熔点琼脂糖之后，再用1mg/mL的溶菌酶消化菌丝体释放DNA，该方法规避了链霉菌基因组DNA容易被氧化而发生降解的缺点。制备好的基因组DNA经脉冲电泳二次回收选择，去除了中小片段等杂质片段的干扰，使得回收片段长度均一，从而有效提高了连接效率和转化效率。
连接产物的脱盐浓缩有助于提高转化效率。而最佳的连接效率往往需要进行载体与外源片段不同摩尔比的预连接实验[9]。经过摸索发现，载体与外源片段在1∶5比例下，连接效率最高。
本实验所构建BAC文库克隆总数达3 456个，容量为链霉菌基因组DNA含量的17.3倍，平均插入片段达55kb，根据经验公式[10]计算，本文库得到任一基因的概率为99.99%，适合于单基因的克隆和分离。本文库的成功构建为进一步克隆链霉菌基因组重要功能基因提供了必备的物质平台。
参考文献
[1]Heia S.，Borgos S.E.F.，Sletta H.et al.Initiation of Polyene Macrolide Biosynthesis：Interplay between Polyketide Synthase Domains and Modules as Revealed via Domain Swapping，Mutagenesis，and Heterologous Complementation[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（19）：6982-6990. [2]刘志恒，姜成林.放线菌现代生物学与生物技术[M].北京：科学出版社，2004.
[3]Wattanachaisaereekul S.，Lantz A.E.，Nielsen ML.，et al. Optimization of heterologous production of the polyketide 6-MSAS in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnology and Bioengineering，2006，97（4）：893-900.
[4]Gagunashvili A.N.，Davidsson S.P.，Jonsson Z.O.，et al.Cloning and heterologus transcription of a polyketide synthase gene from the lichen Solorina crocea[J]. Mycological Research，2009：354-363.
[5]Yuzawa S.，Kim W.，Katz L.，et al.Heterologous production of polyketides by modular type I polyketide synthases in Escherichia coli.，2011，23：1-9.
[6]Shi X.，Zeng H.Y.，Xue Y.D.，et al. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange[J].Plant Methods，2011，7：33.
[7]王万群.武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体（BAC）[D].北京：中国农业科学院，2008.
[8]Wu C.C.，Nimm akayala P.，Santos F.A.，et al. Construction and characterization of a soybean bacterial artificial chromosome library and use of multiple complementary libraries for genome physical mapping [J]. Theor Appl Genet，2004，109（5）：1041-1050.
[9]邱芳，金德敏.温敏核不育水稻5460S细菌人工染色体文库的构建和鉴定[J].中国科学：C辑，1999，29（5）：518-524.
[10]Peterson D.G.，Tomkins J.P.，Frisch D.A.，et al. Construction of plant bacterial artificial chromosome（BAC）libraries An illustrated guide [J]. Journal of Agricultural Genomics，2000，5：1-100.
（责编：张宏民）
关键词：链霉菌；BAC文库；基因组
中图分类号 S435.111 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）24-17-03
Construction of the Bacterial Artificial Chromosome Library of Streptomyces JK-1 Resistance to Magnaporthe oryzae
Zhang Xuejiang et al.
（Institute of Plant Protection and Soil Science，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Diseases，Insect Pests and Weeds Control，Wuhan 430064，China）
Abstract：A genomic bacterial artificial chromosome（BAC）library was constructed using nuclear DNA of Streptomyces JK-1 resistance to Magnaporthe oryzae. The library collected 3 456 recombinant clones carrying inserts with sizes ranging from 40kb to 100kb. The average insert size was about 55kb with empty-vector rate less than 5%. This BAC library represented 17.3 equivalents of Streptomyces genome. The BAC library will help further genome and fucntional gene research.
Key words：Streptomyces；BAC library；Genome
放线菌聚酮合酶基因（polyketide synthase genes，PKSs）合成的聚酮化合物具有广谱生物活性，表现出抗细菌、抗真菌、抗癌、治疗心血管疾病、降低胆固醇等效果[1]。放线菌中最重要的成员链霉菌，其产生的聚酮化合物占人类医用抗生素的60%以上[2]。在过去的几十年里，许多聚酮生物合成途径中的重要基因已被克隆并被异源表达[3-5]。
近年来，本实验室从蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）中分离到一株内生链霉菌JK-1，其次生代谢产物经平板生测实验表明，对稻瘟病菌的抑制率达99%以上。次生代谢产物经质谱分析表明，活性物质属于七烯类化合物，该化合物在化学结构数据库中没有相应的结构，属于一种全新的聚酮化合物。因此本项目试图将本实验室发现的这株链霉菌JK-1基因组中的多烯类聚酮合成酶基因/簇通过构建基因组BAC（Bacterial artificial chromosome）文库的方法克隆出来，并进行生物信息学分析和功能预测，为抗水稻稻瘟病提供新的抗性基因。
1 材料与方法
1.1 实验材料 链霉菌JK-1由本实验室保存，该菌自蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）（于2008年采自中国科学院武汉植物园）内分离得到，其孢子的甘油悬浮液于-80℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 BAC载体的制备 克隆载体pHZAUBAC1[6]由华中农业大学罗美中教授惠赠。pHZAUBAC1质粒采用Qiagen plasmid midi kit提取，用BamHI（NEB）酶切，再用CIAP（NEB）酶脱磷酸化并进行自连反应，用脉冲电泳分离目的DNA片段pIndigoBAC36-S，用电洗脱法回收估测浓度，根据DNA的浓度加入甘油调整终浓度至25ng/μL，分装后于-80℃保存。
1.2.2 高分子量基因组DNA BamHI部分酶切产物的制备 链霉菌JK-1高纯度大分子量基因组DNA凝胶块（plug）的制备参照王万群的实验方法[7]。将制备好的plug做BamHI部分酶切，确定能产生50～150kb范围片段的内切酶用量。设0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8共6个不同用量的BamHI酶浓度梯度，3/8的plug，冰上轻摇2h，然后30℃酶切10min。对酶切产物进行脉冲场凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间0.1～40s，运行16h。根据电泳结果，确定最适内切酶用量。然后做大量酶切，经2次脉冲场电泳、电洗脱法分离纯化50～100kb和100～150kb间的DNA片段的凝胶块，用λDNA来定量所回收大片段DNA的浓度。
1.2.3 BAC文库的构建 回收的大片段DNA与载体按1∶1、5∶1、10∶1的比例进行连接，筛选最佳连接比例。连接产物用30%PEG8000透析，脱盐和浓缩。然后取2μL连接产物转化20μL感受态细胞ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant（Epicentre公司），转化条件：1.25kV/cm，200Ω，25μF。转化产物中加入980μL的SOC培养基，37℃振荡培养1h，涂布LB平板（12.5μg/mL氯霉素、80μg/mL X-gal和100μg/mL IPTG），37℃倒置培养18h，通过蓝白斑筛选，鉴别可能的重组克隆[8]。挑取白色菌落，LB液体培养基37℃ 225r震荡培养18h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切检测插入片段大小和空载率。最后挑取白色克隆到含有70μL冻存培养基的384孔培养板里，37℃培养至培养基液变浑浊，用384针的Replicator将文库复制2份，一并贮存于-80℃低温冰箱保存。 1.2.4 BAC文库的质量分析 从制备好的BAC文库中随机挑取100个克隆，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切，脉冲电泳检测插入片段大小，脉冲条件：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间5～15s，运行15h。计算平均插入片段大小和空载率，估算全基因组覆盖度。
2 结果与分析
2.1 高分子量DNA制备与检测 本研究采用菌丝包埋法制备plug，制备好的plug经酶解释放DNA，蛋白酶K消化处理，脉冲电泳检测表明该方法提取的基因组DNA质量高，片段大，DNA降解少，完全能满足建库需求（图1）。
图1 链霉菌JK-1 HMW DNA脉冲电泳
注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1、2、3泳道为提取的基因组DNA。脉冲电泳条件：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～50s，16h。
2.2 基因组DNA酶切 酶切后脉冲结果显示，第4道的大部分片段集中在50～150kb，所以1/3的plug所用酶量在1.2U和2.4U最佳（图2）。以此为基础进行大量酶切，回收50～100kb及100～150kb的片段。
图2 链霉菌JK-1 HMW DNA的BamHI不完全酶切
注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1～6泳道为1/3 plug分别为0，0.3U，0.6U，1.2U，2.4U，3.6U的BamHI于30℃酶切10min的结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，0.1～40s，16h。
2.3 大片段选择回收 本实验用1.2U BamHI对plug进行了大量酶切，然后用脉冲场电泳分离，切下50～150kb的大片段，再分割成50～100kb、100～150kb的2个胶块，进行第2次片段选择。经过2次选择，有效地去除了较小的片段。
2.4 连接与转化 电泳结果显示本实验的载体质量高纯度好。本实验设置了片段与载体1∶1、5∶1、10∶1这3个梯度连接比例。结果显示，在5∶1的比例下，长出的克隆数目明显多于其它连接比例。连接后的产物经偷袭除盐处理以提高转化效率。
2.5 BAC文库质量检测 随机挑取100个克隆，接种到5mL含有12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 240r/min培养12h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，I-SceI酶切检测插入片段的大小。统计结果显示插入判断长度集中于50～100kb，平均大小55kb，文库空载率低于5%（图3）。链霉菌基因组大小约10M。本文库共有3 456个克隆，覆盖了链霉菌JK-1基因组至少17.3倍。
图3 随机挑取13个链霉菌JK-1 BAC克隆的I-SceI酶切片段大小图谱
注：M：Low range PFG Marke（NEB产品），1～13泳道为BAC克隆的I-SceI酶切结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～15s，16h。 （下转129页）
（上接18页）3 讨论
本文所用的BAC载体pCUGIBAC1由pIndigoBAC536和pGEM-4Z 2个载体连接而成，该载体综合了传统BAC载体稳定性好和链霉菌整合型载体的优势，完全满足了本实验的要求。在制备高质量DNA时是将菌丝体先包埋到低熔点琼脂糖之后，再用1mg/mL的溶菌酶消化菌丝体释放DNA，该方法规避了链霉菌基因组DNA容易被氧化而发生降解的缺点。制备好的基因组DNA经脉冲电泳二次回收选择，去除了中小片段等杂质片段的干扰，使得回收片段长度均一，从而有效提高了连接效率和转化效率。
连接产物的脱盐浓缩有助于提高转化效率。而最佳的连接效率往往需要进行载体与外源片段不同摩尔比的预连接实验[9]。经过摸索发现，载体与外源片段在1∶5比例下，连接效率最高。
本实验所构建BAC文库克隆总数达3 456个，容量为链霉菌基因组DNA含量的17.3倍，平均插入片段达55kb，根据经验公式[10]计算，本文库得到任一基因的概率为99.99%，适合于单基因的克隆和分离。本文库的成功构建为进一步克隆链霉菌基因组重要功能基因提供了必备的物质平台。
参考文献
[1]Heia S.，Borgos S.E.F.，Sletta H.et al.Initiation of Polyene Macrolide Biosynthesis：Interplay between Polyketide Synthase Domains and Modules as Revealed via Domain Swapping，Mutagenesis，and Heterologous Complementation[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（19）：6982-6990. [2]刘志恒，姜成林.放线菌现代生物学与生物技术[M].北京：科学出版社，2004.
[3]Wattanachaisaereekul S.，Lantz A.E.，Nielsen ML.，et al. Optimization of heterologous production of the polyketide 6-MSAS in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnology and Bioengineering，2006，97（4）：893-900.
[4]Gagunashvili A.N.，Davidsson S.P.，Jonsson Z.O.，et al.Cloning and heterologus transcription of a polyketide synthase gene from the lichen Solorina crocea[J]. Mycological Research，2009：354-363.
[5]Yuzawa S.，Kim W.，Katz L.，et al.Heterologous production of polyketides by modular type I polyketide synthases in Escherichia coli.，2011，23：1-9.
[6]Shi X.，Zeng H.Y.，Xue Y.D.，et al. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange[J].Plant Methods，2011，7：33.
[7]王万群.武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体（BAC）[D].北京：中国农业科学院，2008.
[8]Wu C.C.，Nimm akayala P.，Santos F.A.，et al. Construction and characterization of a soybean bacterial artificial chromosome library and use of multiple complementary libraries for genome physical mapping [J]. Theor Appl Genet，2004，109（5）：1041-1050.
[9]邱芳，金德敏.温敏核不育水稻5460S细菌人工染色体文库的构建和鉴定[J].中国科学：C辑，1999，29（5）：518-524.
[10]Peterson D.G.，Tomkins J.P.，Frisch D.A.，et al. Construction of plant bacterial artificial chromosome（BAC）libraries An illustrated guide [J]. Journal of Agricultural Genomics，2000，5：1-100.
（责编：张宏民）