【摘 要】
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目的评价反复冻融对不同浓度的real-time PCR质粒标准品的影响。方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒,紫外分光光度计定量后,根据重组质粒分子量计算其
【机 构】
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珠海市中山大学附属第五医院检验科;
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目的评价反复冻融对不同浓度的real-time PCR质粒标准品的影响。方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒,紫外分光光度计定量后,根据重组质粒分子量计算其拷贝数,稀释成梯度浓度的荧光实时定量PCR的标准品,取1.0×106、1.0×104和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品,反复冻融1、6、11、15次和21次后,以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-time PCR扩增定量,比较量值变化。结果反复冻融21次以内,高中值稳定,低浓度波动相对较大,高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。结论大于1.0×104拷贝/μl的高中浓度的质粒标准品可以耐受21次以内反复冻融,低于1.0×104拷贝/μl的质粒标准品反复冻融后量值变化较大,临床使用的试剂盒所配的低浓度标准品应避免反复冻融。
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