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摘 要:目的 对变链菌总蛋白质的几种提取方法进行比较研究，寻找出最佳的提取方法。方法 分别用超声裂解法、热裂解超声法及反复冻溶超声裂解法来提取变链菌总蛋白质，再对提取的蛋白质进行浓度的测定。结果 反复冻溶超声裂解法所得的蛋白质浓度比其它两种方法高。结论 通过实验对比寻找到了一种有效提取变链菌总蛋白质的方法，为进一步研究变链菌蛋白表达及其对致病性的影响奠定了基础。
关键词:变形链球菌；总蛋白质；提取方法
变形链球菌（简称变链菌）是口腔龋病的主要病原菌，在龋病防治的研究中，变链菌蛋白质组学研究逐渐成为一个新的研究热点。对变链菌总蛋白质进行有效的提取，是开展变链菌蛋白质组学研究的基础。国外文献曾分别报道了几种变链菌总蛋白质的提取方法[1～3]，但未见对这几种提取方法进行比较研究的相关报道。我们在参考国内外相关文献的基础上，对几种提取变链菌总蛋白质的方法进行了系统的比较研究，期望找到一种有效、简单且稳定的提取方法，为进一步开展变链菌蛋白质组学的研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料：
变链菌（S.mutans）Ingbritt C (血清C型) 国际标准株
培养基：BHI液体培养基，BHI固体培养基
裂解液Ⅰ：50mM Tris-Hcl,0.3％ SDS,0.3％ DTT，调节pH至8.0
裂解液Ⅱ：30mM Tris-Hcl，7M 脲，2M 硫脲，4％ CHAPS，5mM PMSF，调节pH至8.0
1.2 实验方法
(1).细菌的培养和收集：将变链菌Ingbritt C标准株从-70℃冰箱中取出，常规复苏，接种于BHI固体培养基，37℃厌氧条件下（80﹪N2,10﹪H2, 10﹪CO2）培养2天后挑取单菌落接种于200mlBHI液体培养基，培养20h后，于4℃、3000rpm离心l5min收集细菌沉淀，洗涤两次后重悬于20ml生理盐水中，震荡混匀后等分为20等份，再次于4℃、3000rpm离心l5min，细菌沉淀保存于-20℃，备用。
(2).细菌的裂解：
超声裂解法：将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，加入1ml裂解液Ⅰ，超声破碎(11KHZ，10S×10次循环，间隔30S，冰浴)，振荡(30S×5，间隔30S，冰浴)，取10μl混悬液涂片进行革兰氏染色。剩余混悬液于4℃、10000rpm离心l5min，收集上清液，取200μl上清液加入4倍体积预冷丙酮沉淀蛋白质，真空冻干为蛋白质粉末保存于-20℃，备用。同时处理3份平行样本；
热裂解超声法：将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，100℃沸水浴15min，加入1ml裂解液Ⅰ，其余步骤同方法1；
反复冻溶超声裂解法：将保存的细菌沉淀反复冻溶3次（-20℃ 30min，20℃ 10min），加入1ml裂解液Ⅱ，其余步骤同方法1。
(3).蛋白质浓度的测定：用1ml超纯水溶解制备的蛋白质粉末，用Bradford蛋白质定量试剂盒测定蛋白质的浓度，测定时每种蛋白质粉末设定3个平行样本。同时绘制标准曲线及样本加标回收，标准曲线蛋白质浓度范围为0mg/ml～2mg/ml。
2 结 果
2.1 提取蛋白质的浓度分析：蛋白质标准曲线为y=0.115+0.823x，相关系数为0.985。样本加标回收率为88.923％。蛋白质粉末在超纯水中的溶解性不佳，溶液中明显存在未溶解的蛋白质颗粒。三种方法所得的蛋白质浓度见表1，方法3所得的蛋白质浓度比其它两种方法高20余倍。
表1. 三种方法提取的蛋白质浓度
方 法1 方 法2 方 法3
蛋白质浓度（mg/ml） 0.0623 0.0712 1.4385
2.2 细菌破碎程度分析：
未经裂解处理的变链菌为革兰氏染色阳性球菌，呈长链状排列（图1）；经方法3处理后细菌呈分散状态，在染色阳性的菌体周围出现染色阴性的菌体碎片（图2），方法1和方法2处理与方法3无明显的差异。
图1.未裂解的变链菌
（革兰氏染色，×1000）
图2. 经方法3处理后的变链菌
（革兰氏染色，×1000）
3 讨 论
变链菌在人类口腔微环境中占有重要的生态地位，是公认的主要致龋菌。变链菌蛋白质组学为龋病的防治研究提供了一个新的途径和平台[1～3]，而其中首要和关键的步骤是提取细菌总蛋白质[4, 5]。有效提取细菌总蛋白质的一个必要步骤就是裂解菌细胞，裂解细胞通常有机械法和非机械法两种方法。非机械法通常是加入一些能降解细胞壁成分的物质（如溶菌酶等）来裂解细胞[1]，其主要缺点是会引入外源性蛋白质，从而影响后续分析[6]；机械法虽克服了这个不足，但通常裂解条件剧烈并耗时[3]。一般来说，裂解方法的选择多依欲裂解细胞的特性和研究目的而定。变链菌为革兰氏染色阳性兼性厌氧球菌，其细胞壁难以破碎，通常采用较为剧烈的超声法来裂解菌细胞。
细菌经裂解处理后，细胞壁破裂，胞内物质溢出，其染色特性和形态可能发生明显变化，故本实验以在光学显微镜下直接观察细菌染色涂片的方法来评价细菌的破碎程度。实验结果显示超声作用是使细菌破碎的主要因素，在超声基础上辅以加热或反复冻融，并未明显增强细菌的破碎程度。
细菌破碎后释放的蛋白质需充分溶解、稳定保存并可用于二维电泳分析。提取蛋白质所用的裂解缓冲液的成分必须能将所有蛋白质转换成单一构象、防止蛋白质氧化和聚集、使疏水性蛋白质溶解、失活蛋白酶及断裂二硫键和氢键[6]。在细胞破碎过程释放的蛋白酶导致蛋白质降解，使高分子蛋白丢失并在二维电泳图谱中出现修饰蛋白点，会增加二维电泳结果分析的复杂性，因此在细胞裂解过程中必须失活蛋白酶[5，6]。在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂、在不含脲的SDS缓冲液中煮沸样品[4]、在低pH环境中[5]及直接在强变性剂如脲、TCA或SDS中裂解样品[6]均可一定程度地抑制蛋白酶，但要完全失活所有的蛋白酶可能是相当困难的。我们采用在裂解缓冲液中加入常用的蛋白酶抑制剂苯甲硫酰氟（PMSF）的方式来失活蛋白酶。脲和硫脲是破坏氢键和疏水相互作用的常用变性剂，能使蛋白质转变成单一结构、促使疏水性蛋白质特别是膜蛋白溶解并避免蛋白质之间相互作用，因此，绝大多数裂解缓冲液中均包含脲和硫脲。但是脲在37℃以上会分解产生异氰酸盐使蛋白质氨甲酰化从而改变其电荷特性[5，6]，因此，采用煮沸方式的裂解缓冲液中不能加入脲或硫脲。去污剂可阻止疏水蛋白域之间的相互作用，避免由于聚集和沉淀引起蛋白质丢失。十二烷基磺酸钠（SDS）是最有效的阴离子去污剂之一，但当样本中SDS浓度高于0.2%时，就可能在二维电泳谱图中出现竖条纹。而使用兼性离子去污剂CHAPS则无此担心，且CHAPS与脲和硫脲结合使用可溶解一些膜内蛋白[5]。裂解缓冲液各成分的作用互补，最终达到使蛋白质完全溶解、解聚、变性和还原的目的[5，6]。本实验比较了两种组分不同的裂解缓冲液溶解变链菌总蛋白质的能力。由于裂解缓冲液的成分如去污剂、DTT等可改变光度计的读数，因此，溶于裂解缓冲液中的蛋白质的浓度难以直接用常用方法如Bradford方法或BCA方法测定。本实验用丙酮沉淀所提取的蛋白质，然后再将蛋白质重新溶于超纯水中用Bradford法测其浓度。研究发现，沉淀后的蛋白质不能完全溶于水中，因此这样测得的蛋白质浓度不能完全代表所提取的蛋白质浓度，但可以用于比较相对浓度的高低。测定结果显示，虽然裂解的3种方式有所不同，但其提取的蛋白质量似乎只与所使用的裂解缓冲液性质有关。用裂解液Ⅱ提取的蛋白质量显著高于裂解液Ⅰ，说明裂解液Ⅱ更能有效地溶解变链菌总蛋白质。研究同时也发现，沉淀后的蛋白质中仍有极少量蛋白质不能溶解，这是由于任何一种沉淀方法都不可能得到100%的蛋白质回收[5，6]。
以上分析显示以裂解液Ⅱ作为裂解缓冲液，采用反复冻融超声的方法可以有效地提取变链菌总蛋白质，具有较好的稳定性和重复性，且操作简单，不需要特殊的仪器。该方法的建立为进一步开展变链菌蛋白质组学研究奠定了基础。
参考文献
[1] Rathsam C,Eaton RE,Simpson cl,et al.Two-Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoretic Analysis of Streptococcus mutans Biofilms.J Proteome Res,2005,4:2161- 2173.
[2] Len AC L,Harty DW S,Jacques NA.Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance. Microbiology ,2004,150:1339–1351.
[3] Welin J,Wilkins JC,Beighton D,et al. Effect of acid shock on protein expression by biofilm cells of Streptococcus mutans.FEMS Microbiology Letters,2003,227:287-293.
[4] Shaw MM,Riederer BM. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.Proteomics,2003,3:1408–1417.
[5] Görg A,Weiss W,Dunn MJ.Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics,2004,4(12)：3665-3685.
[6] López JL. Two- dimensional electrophoresis in proteome expression analysis.J Chromatopraphy B,2007,849:190-202.
关键词:变形链球菌；总蛋白质；提取方法
变形链球菌（简称变链菌）是口腔龋病的主要病原菌，在龋病防治的研究中，变链菌蛋白质组学研究逐渐成为一个新的研究热点。对变链菌总蛋白质进行有效的提取，是开展变链菌蛋白质组学研究的基础。国外文献曾分别报道了几种变链菌总蛋白质的提取方法[1～3]，但未见对这几种提取方法进行比较研究的相关报道。我们在参考国内外相关文献的基础上，对几种提取变链菌总蛋白质的方法进行了系统的比较研究，期望找到一种有效、简单且稳定的提取方法，为进一步开展变链菌蛋白质组学的研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料：
变链菌（S.mutans）Ingbritt C (血清C型) 国际标准株
培养基：BHI液体培养基，BHI固体培养基
裂解液Ⅰ：50mM Tris-Hcl,0.3％ SDS,0.3％ DTT，调节pH至8.0
裂解液Ⅱ：30mM Tris-Hcl，7M 脲，2M 硫脲，4％ CHAPS，5mM PMSF，调节pH至8.0
1.2 实验方法
(1).细菌的培养和收集：将变链菌Ingbritt C标准株从-70℃冰箱中取出，常规复苏，接种于BHI固体培养基，37℃厌氧条件下（80﹪N2,10﹪H2, 10﹪CO2）培养2天后挑取单菌落接种于200mlBHI液体培养基，培养20h后，于4℃、3000rpm离心l5min收集细菌沉淀，洗涤两次后重悬于20ml生理盐水中，震荡混匀后等分为20等份，再次于4℃、3000rpm离心l5min，细菌沉淀保存于-20℃，备用。
(2).细菌的裂解：
超声裂解法：将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，加入1ml裂解液Ⅰ，超声破碎(11KHZ，10S×10次循环，间隔30S，冰浴)，振荡(30S×5，间隔30S，冰浴)，取10μl混悬液涂片进行革兰氏染色。剩余混悬液于4℃、10000rpm离心l5min，收集上清液，取200μl上清液加入4倍体积预冷丙酮沉淀蛋白质，真空冻干为蛋白质粉末保存于-20℃，备用。同时处理3份平行样本；
热裂解超声法：将保存的细菌沉淀于37℃水浴30min，100℃沸水浴15min，加入1ml裂解液Ⅰ，其余步骤同方法1；
反复冻溶超声裂解法：将保存的细菌沉淀反复冻溶3次（-20℃ 30min，20℃ 10min），加入1ml裂解液Ⅱ，其余步骤同方法1。
(3).蛋白质浓度的测定：用1ml超纯水溶解制备的蛋白质粉末，用Bradford蛋白质定量试剂盒测定蛋白质的浓度，测定时每种蛋白质粉末设定3个平行样本。同时绘制标准曲线及样本加标回收，标准曲线蛋白质浓度范围为0mg/ml～2mg/ml。
2 结 果
2.1 提取蛋白质的浓度分析：蛋白质标准曲线为y=0.115+0.823x，相关系数为0.985。样本加标回收率为88.923％。蛋白质粉末在超纯水中的溶解性不佳，溶液中明显存在未溶解的蛋白质颗粒。三种方法所得的蛋白质浓度见表1，方法3所得的蛋白质浓度比其它两种方法高20余倍。
表1. 三种方法提取的蛋白质浓度
方 法1 方 法2 方 法3
蛋白质浓度（mg/ml） 0.0623 0.0712 1.4385
2.2 细菌破碎程度分析：
未经裂解处理的变链菌为革兰氏染色阳性球菌，呈长链状排列（图1）；经方法3处理后细菌呈分散状态，在染色阳性的菌体周围出现染色阴性的菌体碎片（图2），方法1和方法2处理与方法3无明显的差异。
图1.未裂解的变链菌
（革兰氏染色，×1000）
图2. 经方法3处理后的变链菌
（革兰氏染色，×1000）
3 讨 论
变链菌在人类口腔微环境中占有重要的生态地位，是公认的主要致龋菌。变链菌蛋白质组学为龋病的防治研究提供了一个新的途径和平台[1～3]，而其中首要和关键的步骤是提取细菌总蛋白质[4, 5]。有效提取细菌总蛋白质的一个必要步骤就是裂解菌细胞，裂解细胞通常有机械法和非机械法两种方法。非机械法通常是加入一些能降解细胞壁成分的物质（如溶菌酶等）来裂解细胞[1]，其主要缺点是会引入外源性蛋白质，从而影响后续分析[6]；机械法虽克服了这个不足，但通常裂解条件剧烈并耗时[3]。一般来说，裂解方法的选择多依欲裂解细胞的特性和研究目的而定。变链菌为革兰氏染色阳性兼性厌氧球菌，其细胞壁难以破碎，通常采用较为剧烈的超声法来裂解菌细胞。
细菌经裂解处理后，细胞壁破裂，胞内物质溢出，其染色特性和形态可能发生明显变化，故本实验以在光学显微镜下直接观察细菌染色涂片的方法来评价细菌的破碎程度。实验结果显示超声作用是使细菌破碎的主要因素，在超声基础上辅以加热或反复冻融，并未明显增强细菌的破碎程度。
细菌破碎后释放的蛋白质需充分溶解、稳定保存并可用于二维电泳分析。提取蛋白质所用的裂解缓冲液的成分必须能将所有蛋白质转换成单一构象、防止蛋白质氧化和聚集、使疏水性蛋白质溶解、失活蛋白酶及断裂二硫键和氢键[6]。在细胞破碎过程释放的蛋白酶导致蛋白质降解，使高分子蛋白丢失并在二维电泳图谱中出现修饰蛋白点，会增加二维电泳结果分析的复杂性，因此在细胞裂解过程中必须失活蛋白酶[5，6]。在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂、在不含脲的SDS缓冲液中煮沸样品[4]、在低pH环境中[5]及直接在强变性剂如脲、TCA或SDS中裂解样品[6]均可一定程度地抑制蛋白酶，但要完全失活所有的蛋白酶可能是相当困难的。我们采用在裂解缓冲液中加入常用的蛋白酶抑制剂苯甲硫酰氟（PMSF）的方式来失活蛋白酶。脲和硫脲是破坏氢键和疏水相互作用的常用变性剂，能使蛋白质转变成单一结构、促使疏水性蛋白质特别是膜蛋白溶解并避免蛋白质之间相互作用，因此，绝大多数裂解缓冲液中均包含脲和硫脲。但是脲在37℃以上会分解产生异氰酸盐使蛋白质氨甲酰化从而改变其电荷特性[5，6]，因此，采用煮沸方式的裂解缓冲液中不能加入脲或硫脲。去污剂可阻止疏水蛋白域之间的相互作用，避免由于聚集和沉淀引起蛋白质丢失。十二烷基磺酸钠（SDS）是最有效的阴离子去污剂之一，但当样本中SDS浓度高于0.2%时，就可能在二维电泳谱图中出现竖条纹。而使用兼性离子去污剂CHAPS则无此担心，且CHAPS与脲和硫脲结合使用可溶解一些膜内蛋白[5]。裂解缓冲液各成分的作用互补，最终达到使蛋白质完全溶解、解聚、变性和还原的目的[5，6]。本实验比较了两种组分不同的裂解缓冲液溶解变链菌总蛋白质的能力。由于裂解缓冲液的成分如去污剂、DTT等可改变光度计的读数，因此，溶于裂解缓冲液中的蛋白质的浓度难以直接用常用方法如Bradford方法或BCA方法测定。本实验用丙酮沉淀所提取的蛋白质，然后再将蛋白质重新溶于超纯水中用Bradford法测其浓度。研究发现，沉淀后的蛋白质不能完全溶于水中，因此这样测得的蛋白质浓度不能完全代表所提取的蛋白质浓度，但可以用于比较相对浓度的高低。测定结果显示，虽然裂解的3种方式有所不同，但其提取的蛋白质量似乎只与所使用的裂解缓冲液性质有关。用裂解液Ⅱ提取的蛋白质量显著高于裂解液Ⅰ，说明裂解液Ⅱ更能有效地溶解变链菌总蛋白质。研究同时也发现，沉淀后的蛋白质中仍有极少量蛋白质不能溶解，这是由于任何一种沉淀方法都不可能得到100%的蛋白质回收[5，6]。
以上分析显示以裂解液Ⅱ作为裂解缓冲液，采用反复冻融超声的方法可以有效地提取变链菌总蛋白质，具有较好的稳定性和重复性，且操作简单，不需要特殊的仪器。该方法的建立为进一步开展变链菌蛋白质组学研究奠定了基础。
参考文献
[1] Rathsam C,Eaton RE,Simpson cl,et al.Two-Dimensional Fluorescence Difference Gel Electrophoretic Analysis of Streptococcus mutans Biofilms.J Proteome Res,2005,4:2161- 2173.
[2] Len AC L,Harty DW S,Jacques NA.Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance. Microbiology ,2004,150:1339–1351.
[3] Welin J,Wilkins JC,Beighton D,et al. Effect of acid shock on protein expression by biofilm cells of Streptococcus mutans.FEMS Microbiology Letters,2003,227:287-293.
[4] Shaw MM,Riederer BM. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.Proteomics,2003,3:1408–1417.
[5] Görg A,Weiss W,Dunn MJ.Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.Proteomics,2004,4(12)：3665-3685.
[6] López JL. Two- dimensional electrophoresis in proteome expression analysis.J Chromatopraphy B,2007,849:190-202.