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摘要[目的]研究预混系统对于PCR以及其下游试验是否会产生影响。 [方法]采用“dye”及“density”预混的PCR系统与正常PCR系统进行PCR以及下游试验，使用琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop2000检测。[结果]预混系统与正常系统对于PCR产物的特异性以及质量未见明显差别。[结论]预混系统也完全适合于下游的转化、连接、酶切试验。
关键词PCR；预混系统；正常系统
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）07-021-02
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）是体外扩增特异性DNA片段的技术，是DNA重组技术的一次飞跃。近30年间出现许多衍生的PCR技术，如多重PCR、PCR单链构象多态性、实时荧光定量PCR技术，这些技术大大促进了分子克隆的发展，尤其是实时荧光定量PCR技术的发展结合蛋白质定量分析，为研究基因表达及相关蛋白质功能分析提供了有力手段[1-2]。实时荧光定量PCR系统将染色剂SYBR Green I 预混在PCR系统中进行PCR反应，SYBR Green I与双链DNA结合而激发荧光的特性来定量检测[3]。在PCR系统中预混指示剂、聚蔗糖等使得PCR反应完毕后可直接上样检测，使用方便，但对于PCR下游的分子克隆如连接、酶切是否会产生影响尚不明确。笔者使用预混“dye”及“density”的PCR系统（以下简称预混系统）进行PCR以及下游的连接、酶切试验进行验证，正常PCR系统（以下简称正常系统）作为参照，研究预混系统对于PCR以及其下游试验是否会产生影响。
1材料与方法
1.1主要试剂
DNA ladder、限制性内切酶（Hind Ш、Nco I）、T4 DNA连接酶购买于NEB公司，PCR Master Max、p-EGMT载体琼脂糖购买于promega公司，Green PCR Master Max购买于Thermo scientific公司，LB培养基、LB琼脂均购自Invitrogen公司，PCR纯化试剂盒、柱式质粒DNA提取试剂盒、特异性引物购买于生工（上海）生物工程有限公司。
载体与菌株：pGEM-T载体、大肠杆菌JM101为徐州医学院医学生物化学与分子生物学教学实验中心保存。
1.2试验方法
1.2.1PCR反应。50 μl PCR体系：质粒1 μl，2xPCR Master Mix 25 μl，上下游引物各5 μl，无核酶水14 μl。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25个循环；最后72 ℃延伸5 min。
1.2.2PCR产物纯化。使用生工（上海）生物工程有限公司的柱式PCR产物纯化试剂盒，标准操作步骤参见操作手册。
1.2.3连接。取1 μl PCR纯化产物加入含有p-EGMT载体以及T4 DNA连接酶的体系，16 ℃ 水浴连接4 h。
1.2.4转化。取5 μl连接产物，将连接产物加入100 Ul感受态细胞JM101中，冰浴30 min，立即转入42 ℃水浴1 min，然后再转移至冰浴2 min，加入300 μl LB，37 ℃培养1 h后取50 μl涂布于准备好的含有氨苄青霉素的平板，倒置于37 ℃ 培养箱过夜培养。
1.2.5酶切。取10 μl质粒，加入含有Hind Ш、Nco I的双酶切体系，37 ℃ 培养箱酶切1 h。
2结果与分析
2.1PCR产物定量检测
为了检测预混系统对于PCR反应是否产生影响，使用PCR预混系统及正常系统克隆同一个目的基因（711 bp）（图1），仅有目的基因出现在700 bp左右，2种系统的PCR产物均无非特异性条带，使用Nanodrop2000 测定其浓度，3次试验结果平均值分别为73与77 ng/μl，无明显差异。因此，预混系统及正常系统在PCR的特异性及PCR的产量方面无明显差异。
注：1.预混系统PCR；3.正常系统PCR；2，4.DNA laddrer。
图1PCR结果
2.2PCR 产物连接效率检测
为了验证预混系统对于PCR产物的连接有无影响，使用2种系统的PCR产物进行连接，连接产物转化后涂布于具有氨苄抗性的LB琼脂平板，过夜培养后随机挑选6个菌落进行质粒DNA的小量制备，然后用琼脂糖凝胶电泳检测其大小，结果见图2，由图2可知，3号质粒的移动较其余质粒慢，表示形成重组质粒的可能性较大，经过酶切鉴定确认为正确的重组子。此试验重复5次，得出预混系统与正常系统的连接效率分别为23.3%、26.7%，两者并无明显差别，因此，认为预混系统与正常系统对PCR下游连接试验无明显差异。
注：3.正确连接的重组子；1、2、4、5、6.未连入的闭环载体。
图2连接效率检测
2.3酶切鉴定重组子
使用酶切法鉴定重组子，选择预混系统与正常系统转化的重组子，在设计引物时上下游引物中分别加入酶切位点Hind Ш与Nco I，因此使用Hind Ш、Nco I进行双酶切可以将目的基因切下。由图3可知，预混系统与正常系统转化的重组子酶切结果有2条亮带，分子量较大的是p-EGMT载体，分子量较小的是目的基因，因不明原因使得DNA ladder中条带分辨不清，但仍可以判断目的基因（711 bp）在500～1 000 bp，考虑到双酶切且无非特异性条带，因此可以断定500～1 000 bp的条带是目的基因。对于PCR下游的酶切反应，预混系统与正常系统无明显差异。
3讨论
PCR 技术是现代分子生物学和生物工程技术的里程碑，由于研究目的、技术要求不同，商品化的PCR试剂盒也根据实
际需要作适当的调整，形成了适合现代科学研究的技术平台。
注：1.预混系统连接重组子的酶切产物；2.正常系统连接重组子的酶切产物；3.DNA ladder。
图3酶切鉴定重组子
该研究针对预混“dye”及“density”的PCR系统进行了多项检测，未发现和正常PCR系统的差异，且可以直接上样检测，在操作上简化了步骤，特别适合试验教学的开展。
另外，PCR系统经过不断创新出现了大量的衍生品试剂盒，对于PCR操作的成功率以及便利性具有很大提高，如DNA Taq酶经冻融多次后仍具有很高的活性，可以将DNA Taq酶、Mg2+ 、dNTP等按照一定比例混合在缓冲液中，大大简化了PCR操作步骤，提高Mg2+ 浓度可以拮抗染色剂、指示剂等对于PCR系统的抑制，出现了SYBR等染色剂预混的实时定量PCR试剂盒，对于核酸与蛋白质功能的研究提供了新的手段[4]；针对模板链的特点也出现了一些PCR试剂盒，如高GC含量PCR试剂盒、超长链PCR试剂盒、热启动PCR试剂盒等。随着技术的发展及不断创新，PCR 技术正向简便、快捷、个性化、高质量、智能化的方向发展，同时PCR 技术的应用也将不断深入到科学研究的更多方面。
参考文献
[1]
郑景生，吕蓓.PCR 技术及实用方法[J].分子植物育种，2006，1（3）： 381-394.
[2] 李玉梅，姚纪元，吴静.PCR-SSCP 技术的研究及应用进展[J].生物技术通报，2007（6）：71-74.
[3] 刘歆，徐根明，郭江峰，等.基于SYBR Green I的双链DNA定量方法[J].中国生物工程杂志，2008，28（1）： 55-60.
[4] TUMA R S，BEAUDET M P，JIN X K，et al.Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain：A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transillu minators[J].Analytical Biochemistry，1999，268：278-288.
关键词PCR；预混系统；正常系统
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）07-021-02
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）是体外扩增特异性DNA片段的技术，是DNA重组技术的一次飞跃。近30年间出现许多衍生的PCR技术，如多重PCR、PCR单链构象多态性、实时荧光定量PCR技术，这些技术大大促进了分子克隆的发展，尤其是实时荧光定量PCR技术的发展结合蛋白质定量分析，为研究基因表达及相关蛋白质功能分析提供了有力手段[1-2]。实时荧光定量PCR系统将染色剂SYBR Green I 预混在PCR系统中进行PCR反应，SYBR Green I与双链DNA结合而激发荧光的特性来定量检测[3]。在PCR系统中预混指示剂、聚蔗糖等使得PCR反应完毕后可直接上样检测，使用方便，但对于PCR下游的分子克隆如连接、酶切是否会产生影响尚不明确。笔者使用预混“dye”及“density”的PCR系统（以下简称预混系统）进行PCR以及下游的连接、酶切试验进行验证，正常PCR系统（以下简称正常系统）作为参照，研究预混系统对于PCR以及其下游试验是否会产生影响。
1材料与方法
1.1主要试剂
DNA ladder、限制性内切酶（Hind Ш、Nco I）、T4 DNA连接酶购买于NEB公司，PCR Master Max、p-EGMT载体琼脂糖购买于promega公司，Green PCR Master Max购买于Thermo scientific公司，LB培养基、LB琼脂均购自Invitrogen公司，PCR纯化试剂盒、柱式质粒DNA提取试剂盒、特异性引物购买于生工（上海）生物工程有限公司。
载体与菌株：pGEM-T载体、大肠杆菌JM101为徐州医学院医学生物化学与分子生物学教学实验中心保存。
1.2试验方法
1.2.1PCR反应。50 μl PCR体系：质粒1 μl，2xPCR Master Mix 25 μl，上下游引物各5 μl，无核酶水14 μl。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25个循环；最后72 ℃延伸5 min。
1.2.2PCR产物纯化。使用生工（上海）生物工程有限公司的柱式PCR产物纯化试剂盒，标准操作步骤参见操作手册。
1.2.3连接。取1 μl PCR纯化产物加入含有p-EGMT载体以及T4 DNA连接酶的体系，16 ℃ 水浴连接4 h。
1.2.4转化。取5 μl连接产物，将连接产物加入100 Ul感受态细胞JM101中，冰浴30 min，立即转入42 ℃水浴1 min，然后再转移至冰浴2 min，加入300 μl LB，37 ℃培养1 h后取50 μl涂布于准备好的含有氨苄青霉素的平板，倒置于37 ℃ 培养箱过夜培养。
1.2.5酶切。取10 μl质粒，加入含有Hind Ш、Nco I的双酶切体系，37 ℃ 培养箱酶切1 h。
2结果与分析
2.1PCR产物定量检测
为了检测预混系统对于PCR反应是否产生影响，使用PCR预混系统及正常系统克隆同一个目的基因（711 bp）（图1），仅有目的基因出现在700 bp左右，2种系统的PCR产物均无非特异性条带，使用Nanodrop2000 测定其浓度，3次试验结果平均值分别为73与77 ng/μl，无明显差异。因此，预混系统及正常系统在PCR的特异性及PCR的产量方面无明显差异。
注：1.预混系统PCR；3.正常系统PCR；2，4.DNA laddrer。
图1PCR结果
2.2PCR 产物连接效率检测
为了验证预混系统对于PCR产物的连接有无影响，使用2种系统的PCR产物进行连接，连接产物转化后涂布于具有氨苄抗性的LB琼脂平板，过夜培养后随机挑选6个菌落进行质粒DNA的小量制备，然后用琼脂糖凝胶电泳检测其大小，结果见图2，由图2可知，3号质粒的移动较其余质粒慢，表示形成重组质粒的可能性较大，经过酶切鉴定确认为正确的重组子。此试验重复5次，得出预混系统与正常系统的连接效率分别为23.3%、26.7%，两者并无明显差别，因此，认为预混系统与正常系统对PCR下游连接试验无明显差异。
注：3.正确连接的重组子；1、2、4、5、6.未连入的闭环载体。
图2连接效率检测
2.3酶切鉴定重组子
使用酶切法鉴定重组子，选择预混系统与正常系统转化的重组子，在设计引物时上下游引物中分别加入酶切位点Hind Ш与Nco I，因此使用Hind Ш、Nco I进行双酶切可以将目的基因切下。由图3可知，预混系统与正常系统转化的重组子酶切结果有2条亮带，分子量较大的是p-EGMT载体，分子量较小的是目的基因，因不明原因使得DNA ladder中条带分辨不清，但仍可以判断目的基因（711 bp）在500～1 000 bp，考虑到双酶切且无非特异性条带，因此可以断定500～1 000 bp的条带是目的基因。对于PCR下游的酶切反应，预混系统与正常系统无明显差异。
3讨论
PCR 技术是现代分子生物学和生物工程技术的里程碑，由于研究目的、技术要求不同，商品化的PCR试剂盒也根据实
际需要作适当的调整，形成了适合现代科学研究的技术平台。
注：1.预混系统连接重组子的酶切产物；2.正常系统连接重组子的酶切产物；3.DNA ladder。
图3酶切鉴定重组子
该研究针对预混“dye”及“density”的PCR系统进行了多项检测，未发现和正常PCR系统的差异，且可以直接上样检测，在操作上简化了步骤，特别适合试验教学的开展。
另外，PCR系统经过不断创新出现了大量的衍生品试剂盒，对于PCR操作的成功率以及便利性具有很大提高，如DNA Taq酶经冻融多次后仍具有很高的活性，可以将DNA Taq酶、Mg2+ 、dNTP等按照一定比例混合在缓冲液中，大大简化了PCR操作步骤，提高Mg2+ 浓度可以拮抗染色剂、指示剂等对于PCR系统的抑制，出现了SYBR等染色剂预混的实时定量PCR试剂盒，对于核酸与蛋白质功能的研究提供了新的手段[4]；针对模板链的特点也出现了一些PCR试剂盒，如高GC含量PCR试剂盒、超长链PCR试剂盒、热启动PCR试剂盒等。随着技术的发展及不断创新，PCR 技术正向简便、快捷、个性化、高质量、智能化的方向发展，同时PCR 技术的应用也将不断深入到科学研究的更多方面。
参考文献
[1]
郑景生，吕蓓.PCR 技术及实用方法[J].分子植物育种，2006，1（3）： 381-394.
[2] 李玉梅，姚纪元，吴静.PCR-SSCP 技术的研究及应用进展[J].生物技术通报，2007（6）：71-74.
[3] 刘歆，徐根明，郭江峰，等.基于SYBR Green I的双链DNA定量方法[J].中国生物工程杂志，2008，28（1）： 55-60.
[4] TUMA R S，BEAUDET M P，JIN X K，et al.Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain：A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transillu minators[J].Analytical Biochemistry，1999，268：278-288.