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摘 要：通过对水稻籼型恢复系明恢86组培变异后代的筛选，得到1个棉絮状花序突变体ecp1（encapsulated cotton panicle 1）。棉絮状花序突变体表现生育期内水稻抽穗异常，其小穗部被白色类棉絮物质囊状包裹，无法形成正常的稻穗，进而导致无法结实。遗传分析表明，ecp1受单一隐性核基因控制。利用籼稻品种93-11与ecp1突变体杂交的F2群体，通过SSR和InDel标记，将ecp1定位于水稻第8染色体约240 kb的区间。研究结果为ecp1基因的克隆和功能分析奠定了基础。
关键词：水稻;棉絮状花序;突变体;鉴定;基因定位
中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）09-002
Abstract： A encapsulated cotton panicle mutant （ecp1） was obtained by screening the tissue culture and variant progenies of restorer line Minghui 86 of indica rice. The encapsulated cotton panicle mutant showed abnormal rice heading during the growth period， and its spikelet was enveloped by white cottonlike material， which could not form normal rice spike， and thus could not seed. The genetic analysis showed that ecp1 was controlled by a single recessive nuclear gene. F2 colony from a hybrid of indica rice variety 93-11 and ecp1 mutant was used to locate ecp1 in the region of about 240 kb on chromosome 8 of rice by SSR and InDel markers. The results of this study laid a foundation for the cloning and functional analysis of ecp1 gene.
Key words： Rice; Encapsulated cotton panicle; Mutant; Identification; Gene localization
水稻被广泛栽培，是世界范围内最重要的粮食作物之一。其产量不但同光照、温度、水分等环境因素相关，而且同自身分蘖、粒型、穗型等息息相关。鉴于水稻的小穗着生于侧生分枝上，而不是着生在主穗轴上，故其花序称为总状花序。又因为水稻花序形似圆锥，所以又被称为圆锥花序[1]。水稻花序是否可以正常发育影响着育种学家特别关心的产量问题。因此，对水稻的花序以及花器官发育研究一直以来都是水稻分子遗传学研究的热点问题之一。
至今，一些调控水稻花序发育的相关基因或数量性状位点（QTL）陆续被克隆。其中，短穗基因SP1（short panicle1） 调控水稻枝梗分生组织的伸长。此突变体枝梗原基的发育起始正常，但在枝梗延伸时出现严重障碍，因而导致短穗[2-3]。DEP2（dense and erect panicle2） 基因则编码了1个植物特有的未知蛋白，其主要影响一、二级枝梗和穗轴的伸长[2-4]。OsAPO1/SCM2（aberrant panicle organization 1） 基因造成枝梗分生组织退化时间的延长，正调节小穗数和一级枝梗的数目[2-6]。IPA1（ideal plant architecture） 、TAW1（tawawa 1） 和OsASP1（aberrant spikelet and panicle 1） 等基因则是在水稻花序发育过程中，目前已发现的影响枝梗分生组织向小穗分生组织转换的主要基因[7-9]。上述一系列花分生组织决定基因的发现为理解植物花的形成发育机制提供了分子基础。目前为止，虽然已发现和克隆了部分花序相关基因，但是对花在花序中着生位置和花序发育的遗传调控机制并不清楚，调控花序发育的相关基因有待进一步发现和研究。因此继续对植物花序形态突变体的研究很有必要。
本实验室获得了1例水稻棉絮状花序突变体，对该突变体进行遗传分析，结果表明突变体ecp1定位于水稻第8染色体约240 kb的区间。本研究对水稻的棉絮状花序突变体进行了形态特征和性状观察、遗传分析以及基因初步定位，为克隆和研究该基因打下了基础。
1 材料与方法
1.1 研究材料
ecp1突变体经籼稻恢复系明恢86组织培养的后代中筛选得到;其他供试材料：ecp1的原始野生型品種明恢 86、 籼稻品种93-11及粳稻品种02428，均由福建省农业遗传工程重点实验室保留和提供。
1.2 表型鉴定
研究材料ecp1突变体、籼稻品种93-11、野生型明恢86以及粳稻品种02428均种植于福建省农业科学院生物技术研究所福州寿山基地，在整个生长发育期内，对野生型和突变体材料的表型进行观察并记载。
1.3 群体构建和遗传分析
分别以野生型明恢 86、籼稻品种93-11和粳稻品种02428为母本，ecp1突变体为父本，配制F2分离群体。于抽穗期分别调查和统计F2群体中正常株与突变株的数量，继而计算出正常株和突变株的分离比，然后进行卡平方测验。
1.4 分子标记试验 根据Gramene 网站（http：//www.gramene.org/）提供的RM系列水稻的SSR标记进行连锁分析和初定位。继而利用Grame网站的SSRIT软件扫描粳稻品种Nipponbare（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/download/）的基因组序列，在目标基因所在区域内查找出新的SSR位点，并通过BLAST对Nipponbare和籼稻品种93-11（http：//rice.genomics.org.cn/rice/link/download.jsp） 的基因组序列进行比对，寻找插入缺失（InDel）位点。最后利用Web-Premier （http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）软件，在SSR和InDel 的两侧设计特异引物来开发新的SSR和InDel标记。
1.5 ecp1基因定位
对由水稻ecp1突变体和籼稻品种93-11配制出的F2群体进行基因定位。运用BSA（Bulked segregant analysis）原理，从F2群体中随机抽样，选取出正常植株和突变植株各10株，通过CTAB法提取出总DNA分别构建正常DNA池和ecp1突变DNA池。PCR反应体系及PCR產物检测参照林艳等[10]的方法。以两亲本为对照，根据本实验室已经筛选出来的多态性分子标记，选取水稻的12条染色体上均匀分布的480对分子标记，快速寻找到其中与目标基因连锁的部分标记。进一步选取F2群体中的20个随机水稻棉絮状花序突变体单株，对其进行验证，确定基因所在染色体。最后利用该标记所在区域的多态性，新开发出InDel标记并分析F3分离群体的180个单株，对目标基因进行了定位。
2 结果与分析
2.1 ecp1突变体的形态特征和性状分析
自然条件下，ecp1突变体表现为生长势弱，分蘖数少，穗不能正常发育，呈棉絮状。在苗期营养生长正常，表型和野生型（明恢86）相似，分蘖期表现为少分蘖。抽穗期，突变体穗不能正常抽出，不能形成正常枝梗及小穗，类似棉絮（图1）。因此，将该突变体命名为棉絮状花序突变体encapsulated cotton panicle 1（ecp1）。
2.2 ecp1突变体的遗传分析
ecp1突变体与其野生型明恢86、籼稻品种9311和粳稻品种02428进行杂交，F1代植株均发育正常，可以正常抽穗结实。F1自交获得的F2，经调查统计，ecp1/明恢86、ecp1/9311和ecp1/02488的F2代均出现正常植株与棉絮状花序突变植株的分离，分离比例分别为416∶120、423∶138和730∶233，卡平方分析表明3个不同群体分离比均符合3∶1的分离比（表1），说明该突变性状是由单隐性核基因控制。并且因为在不同的遗传背景下，突变体均能表现出明显的棉絮状花序表型，表明该突变性状能够稳定遗传。
2.3 ecp1突变体的基因定位
利用在两亲本间有多态性，分布于水稻12条染色体的480对SSR引物对两个近等基因池进行筛选，发现位于第8染色体相邻的3对SSR引物（RM1376、RM3572和RM3215）对两基因池扩增出具有明显多态性的DNA片段（图2），说明它们可能与目标基因ecp1连锁。进一步用这3个标记对138个F2突变株进行分析。结果表明，ecp1基因位于RM1376和RM3572之间，与RM1376遗传距离为3.1 cM，与RM3572的遗传距离则为3.3 cM。
将分离群体进一步扩大到180个隐性单株，参考明恢63和9311的基因组序列，根据分子标记RM3572在9311基因组序列中对应的物理位置，在其上游附近开发了19对大小在80～150 bp的 InDel标记。其中InDel0451、InDel0581和InDel5143这3对引物在群体中扩增出多态性条带（表2），利用RM3572和这3对InDel标记引物对上述交换单株进行扩增，最终将突变基因定位在InDel0451和InDel0581之间，与InDel5143共分离，突变基因与两标记InDel0451和InDel0581之间的物理距离分别为32 kb与108 kb（图3）。
3 讨论与结论
植物的花序是一个比营养器官更为复杂的存在，是在植物花的发育过程中，营养生长向生殖生长转变所形成的结构。近些年来，随着分子生物学的发展，多个与植物花发育相关的基因以拟南芥和金鱼草为模式植物被发现和获得，其中一系列花分生组织决定基因的发现尤为重要，为解释植物花的形成发育机制提供了分子基础[11]。对水稻花序突变体及其调控基因进行研究，有助于解析水稻花序发育的调控机理，对水稻高产分子设计育种研究具有重要的指导意义。
本研究结果发现，ecp1突变体出现了穗长变短，花序被白色类棉絮状叶鞘包裹，无法识别正常小穗结构，单穗无法结实等突变表型。遗传分析显示，ecp1受1对隐性单基因控制，并将其定位在水稻第8染色体上前段约240 kb 区间内，与已报道的水稻花序相关突变基因asp1的定位区间相近。Asp1 突变体枝梗发育无序，花序排列不规则，小穗畸形[9]。本研究ecp1突变体与其表型相似，但呈现出特有的棉絮状包裹花序的现象，导致完全无法结实。至于ecp1突变体与asp1突变体是否是同一基因的突变位点不同导致的表型不同，还是因突变体遗传背景不同所致，还需要进一步对ecp1突变体进行序列测定和遗传共分离分析。同时，对ecp1突变体与其他突变体的遗传背景差异进行研究，将有助于深入了解ecp1基因调控水稻花序形成及发育的调控机制。
参考文献：
[2]高继平，祁 澎，林鸿宣.水稻产量数量性状的遗传调控机制研究进展[J].中国科学：生命科学，2013，43（12）：1007-1015. [3]汪 庆，汪得凯，陶跃之.一个新的水稻半矮化小穗突变体的遗传分析与基因定位[J].中国水稻科学，2011，25（6）：677-680.
[4]卢 寰，时振英.水稻穗发育的分子生物学研究进展[J].植物生理学报，2013，49（2）：111-121.
[5]DOI K，IZAWA T，FUSE T，et al.Ehd1，a Btype response regulator in rice，confers shortday promotion of flowering and controls FTlike gene expression independently of Hd1[J].Genes & Development，2004，18（8）：926-936.
[6]KOJIMA S，TAKAHASHI Y，KOBAYASHI Y，et al.Hd3a，a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene，promotes transition to flowering downstream of Hd1 under shortday conditions[J].Plant & Cell Physiology，2002，43（10）：1096-1105.
[7]JIAO Y Q，WANG Y H，XUE D W，et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J].Nature Genetics，2010，42（6）：541-544.
[8]LU Z F，YU H，XIONG G S，et al.Genomewide binding analysis of the transcription activator ideal plant architecture1 reveals a complex network regulating rice plant architecture[J].The Plant Cell，2013，25（10）：3743-3759.
[9]YOSHIDA A，OHMORI Y，KITANO H，et al.ANERRANT SPIKELET and PANICLE1，encoding a TOPLESS related transcriptional corepressor，is involved in the regulation of meristem fate in rice[J].The Plant Journal：Cell and Molecular Biology，2012，70（2）：327-339.
[10]林艷，陈在杰，田大刚，等.水稻类病斑及早衰突变体lms1的鉴定及基因初步定位[J].福建农业学报， 2014，29（1）：29-34.
[11]卢海敏，高廷旺，单世华，等.植物开花相关基因研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（5）：1803-1805.
（责任编辑：柯文辉）
关键词：水稻;棉絮状花序;突变体;鉴定;基因定位
中图分类号：S511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）09-002
Abstract： A encapsulated cotton panicle mutant （ecp1） was obtained by screening the tissue culture and variant progenies of restorer line Minghui 86 of indica rice. The encapsulated cotton panicle mutant showed abnormal rice heading during the growth period， and its spikelet was enveloped by white cottonlike material， which could not form normal rice spike， and thus could not seed. The genetic analysis showed that ecp1 was controlled by a single recessive nuclear gene. F2 colony from a hybrid of indica rice variety 93-11 and ecp1 mutant was used to locate ecp1 in the region of about 240 kb on chromosome 8 of rice by SSR and InDel markers. The results of this study laid a foundation for the cloning and functional analysis of ecp1 gene.
Key words： Rice; Encapsulated cotton panicle; Mutant; Identification; Gene localization
水稻被广泛栽培，是世界范围内最重要的粮食作物之一。其产量不但同光照、温度、水分等环境因素相关，而且同自身分蘖、粒型、穗型等息息相关。鉴于水稻的小穗着生于侧生分枝上，而不是着生在主穗轴上，故其花序称为总状花序。又因为水稻花序形似圆锥，所以又被称为圆锥花序[1]。水稻花序是否可以正常发育影响着育种学家特别关心的产量问题。因此，对水稻的花序以及花器官发育研究一直以来都是水稻分子遗传学研究的热点问题之一。
至今，一些调控水稻花序发育的相关基因或数量性状位点（QTL）陆续被克隆。其中，短穗基因SP1（short panicle1） 调控水稻枝梗分生组织的伸长。此突变体枝梗原基的发育起始正常，但在枝梗延伸时出现严重障碍，因而导致短穗[2-3]。DEP2（dense and erect panicle2） 基因则编码了1个植物特有的未知蛋白，其主要影响一、二级枝梗和穗轴的伸长[2-4]。OsAPO1/SCM2（aberrant panicle organization 1） 基因造成枝梗分生组织退化时间的延长，正调节小穗数和一级枝梗的数目[2-6]。IPA1（ideal plant architecture） 、TAW1（tawawa 1） 和OsASP1（aberrant spikelet and panicle 1） 等基因则是在水稻花序发育过程中，目前已发现的影响枝梗分生组织向小穗分生组织转换的主要基因[7-9]。上述一系列花分生组织决定基因的发现为理解植物花的形成发育机制提供了分子基础。目前为止，虽然已发现和克隆了部分花序相关基因，但是对花在花序中着生位置和花序发育的遗传调控机制并不清楚，调控花序发育的相关基因有待进一步发现和研究。因此继续对植物花序形态突变体的研究很有必要。
本实验室获得了1例水稻棉絮状花序突变体，对该突变体进行遗传分析，结果表明突变体ecp1定位于水稻第8染色体约240 kb的区间。本研究对水稻的棉絮状花序突变体进行了形态特征和性状观察、遗传分析以及基因初步定位，为克隆和研究该基因打下了基础。
1 材料与方法
1.1 研究材料
ecp1突变体经籼稻恢复系明恢86组织培养的后代中筛选得到;其他供试材料：ecp1的原始野生型品種明恢 86、 籼稻品种93-11及粳稻品种02428，均由福建省农业遗传工程重点实验室保留和提供。
1.2 表型鉴定
研究材料ecp1突变体、籼稻品种93-11、野生型明恢86以及粳稻品种02428均种植于福建省农业科学院生物技术研究所福州寿山基地，在整个生长发育期内，对野生型和突变体材料的表型进行观察并记载。
1.3 群体构建和遗传分析
分别以野生型明恢 86、籼稻品种93-11和粳稻品种02428为母本，ecp1突变体为父本，配制F2分离群体。于抽穗期分别调查和统计F2群体中正常株与突变株的数量，继而计算出正常株和突变株的分离比，然后进行卡平方测验。
1.4 分子标记试验 根据Gramene 网站（http：//www.gramene.org/）提供的RM系列水稻的SSR标记进行连锁分析和初定位。继而利用Grame网站的SSRIT软件扫描粳稻品种Nipponbare（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/download/）的基因组序列，在目标基因所在区域内查找出新的SSR位点，并通过BLAST对Nipponbare和籼稻品种93-11（http：//rice.genomics.org.cn/rice/link/download.jsp） 的基因组序列进行比对，寻找插入缺失（InDel）位点。最后利用Web-Premier （http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）软件，在SSR和InDel 的两侧设计特异引物来开发新的SSR和InDel标记。
1.5 ecp1基因定位
对由水稻ecp1突变体和籼稻品种93-11配制出的F2群体进行基因定位。运用BSA（Bulked segregant analysis）原理，从F2群体中随机抽样，选取出正常植株和突变植株各10株，通过CTAB法提取出总DNA分别构建正常DNA池和ecp1突变DNA池。PCR反应体系及PCR產物检测参照林艳等[10]的方法。以两亲本为对照，根据本实验室已经筛选出来的多态性分子标记，选取水稻的12条染色体上均匀分布的480对分子标记，快速寻找到其中与目标基因连锁的部分标记。进一步选取F2群体中的20个随机水稻棉絮状花序突变体单株，对其进行验证，确定基因所在染色体。最后利用该标记所在区域的多态性，新开发出InDel标记并分析F3分离群体的180个单株，对目标基因进行了定位。
2 结果与分析
2.1 ecp1突变体的形态特征和性状分析
自然条件下，ecp1突变体表现为生长势弱，分蘖数少，穗不能正常发育，呈棉絮状。在苗期营养生长正常，表型和野生型（明恢86）相似，分蘖期表现为少分蘖。抽穗期，突变体穗不能正常抽出，不能形成正常枝梗及小穗，类似棉絮（图1）。因此，将该突变体命名为棉絮状花序突变体encapsulated cotton panicle 1（ecp1）。
2.2 ecp1突变体的遗传分析
ecp1突变体与其野生型明恢86、籼稻品种9311和粳稻品种02428进行杂交，F1代植株均发育正常，可以正常抽穗结实。F1自交获得的F2，经调查统计，ecp1/明恢86、ecp1/9311和ecp1/02488的F2代均出现正常植株与棉絮状花序突变植株的分离，分离比例分别为416∶120、423∶138和730∶233，卡平方分析表明3个不同群体分离比均符合3∶1的分离比（表1），说明该突变性状是由单隐性核基因控制。并且因为在不同的遗传背景下，突变体均能表现出明显的棉絮状花序表型，表明该突变性状能够稳定遗传。
2.3 ecp1突变体的基因定位
利用在两亲本间有多态性，分布于水稻12条染色体的480对SSR引物对两个近等基因池进行筛选，发现位于第8染色体相邻的3对SSR引物（RM1376、RM3572和RM3215）对两基因池扩增出具有明显多态性的DNA片段（图2），说明它们可能与目标基因ecp1连锁。进一步用这3个标记对138个F2突变株进行分析。结果表明，ecp1基因位于RM1376和RM3572之间，与RM1376遗传距离为3.1 cM，与RM3572的遗传距离则为3.3 cM。
将分离群体进一步扩大到180个隐性单株，参考明恢63和9311的基因组序列，根据分子标记RM3572在9311基因组序列中对应的物理位置，在其上游附近开发了19对大小在80～150 bp的 InDel标记。其中InDel0451、InDel0581和InDel5143这3对引物在群体中扩增出多态性条带（表2），利用RM3572和这3对InDel标记引物对上述交换单株进行扩增，最终将突变基因定位在InDel0451和InDel0581之间，与InDel5143共分离，突变基因与两标记InDel0451和InDel0581之间的物理距离分别为32 kb与108 kb（图3）。
3 讨论与结论
植物的花序是一个比营养器官更为复杂的存在，是在植物花的发育过程中，营养生长向生殖生长转变所形成的结构。近些年来，随着分子生物学的发展，多个与植物花发育相关的基因以拟南芥和金鱼草为模式植物被发现和获得，其中一系列花分生组织决定基因的发现尤为重要，为解释植物花的形成发育机制提供了分子基础[11]。对水稻花序突变体及其调控基因进行研究，有助于解析水稻花序发育的调控机理，对水稻高产分子设计育种研究具有重要的指导意义。
本研究结果发现，ecp1突变体出现了穗长变短，花序被白色类棉絮状叶鞘包裹，无法识别正常小穗结构，单穗无法结实等突变表型。遗传分析显示，ecp1受1对隐性单基因控制，并将其定位在水稻第8染色体上前段约240 kb 区间内，与已报道的水稻花序相关突变基因asp1的定位区间相近。Asp1 突变体枝梗发育无序，花序排列不规则，小穗畸形[9]。本研究ecp1突变体与其表型相似，但呈现出特有的棉絮状包裹花序的现象，导致完全无法结实。至于ecp1突变体与asp1突变体是否是同一基因的突变位点不同导致的表型不同，还是因突变体遗传背景不同所致，还需要进一步对ecp1突变体进行序列测定和遗传共分离分析。同时，对ecp1突变体与其他突变体的遗传背景差异进行研究，将有助于深入了解ecp1基因调控水稻花序形成及发育的调控机制。
参考文献：
[2]高继平，祁 澎，林鸿宣.水稻产量数量性状的遗传调控机制研究进展[J].中国科学：生命科学，2013，43（12）：1007-1015. [3]汪 庆，汪得凯，陶跃之.一个新的水稻半矮化小穗突变体的遗传分析与基因定位[J].中国水稻科学，2011，25（6）：677-680.
[4]卢 寰，时振英.水稻穗发育的分子生物学研究进展[J].植物生理学报，2013，49（2）：111-121.
[5]DOI K，IZAWA T，FUSE T，et al.Ehd1，a Btype response regulator in rice，confers shortday promotion of flowering and controls FTlike gene expression independently of Hd1[J].Genes & Development，2004，18（8）：926-936.
[6]KOJIMA S，TAKAHASHI Y，KOBAYASHI Y，et al.Hd3a，a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene，promotes transition to flowering downstream of Hd1 under shortday conditions[J].Plant & Cell Physiology，2002，43（10）：1096-1105.
[7]JIAO Y Q，WANG Y H，XUE D W，et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J].Nature Genetics，2010，42（6）：541-544.
[8]LU Z F，YU H，XIONG G S，et al.Genomewide binding analysis of the transcription activator ideal plant architecture1 reveals a complex network regulating rice plant architecture[J].The Plant Cell，2013，25（10）：3743-3759.
[9]YOSHIDA A，OHMORI Y，KITANO H，et al.ANERRANT SPIKELET and PANICLE1，encoding a TOPLESS related transcriptional corepressor，is involved in the regulation of meristem fate in rice[J].The Plant Journal：Cell and Molecular Biology，2012，70（2）：327-339.
[10]林艷，陈在杰，田大刚，等.水稻类病斑及早衰突变体lms1的鉴定及基因初步定位[J].福建农业学报， 2014，29（1）：29-34.
[11]卢海敏，高廷旺，单世华，等.植物开花相关基因研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（5）：1803-1805.
（责任编辑：柯文辉）