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摘要：目的 对九龙藤多甲氧基黄酮进行快速分离鉴定。方法：采用HPLC-Q-TOF/MS法追踪九龙藤中的多甲氧基黄酮，采用制备液相法进行快速分离，以质谱结合核磁共振法进行快速鉴定。结果：利用HPLC-Q-TOF/MS分析，发现了九龙藤乙酸乙酯萃取部位中的5个多甲氧基黄酮，以制备液相法快速分离了其中1个，通过质谱及核磁共振波谱鉴定为5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮。结论：该方法适用于九龙藤多甲氧基黄酮的快速分离鉴定，为其药效筛选提供快速样品制备方法。
关键词：九龙藤;多甲氧基黄酮;HPLC-MS/MS;分离鉴定
分类号：TQ461
九龙藤（Bauhinia championii Benth.） 为豆科羊蹄甲属植物，别名过岗龙、龙须藤、梅花入骨丹等，分布于浙江、广东、广西、福建等省[1]。九龙藤性苦、辛、平，无毒，具有祛风除湿、活血止痛、健脾理气等功效[2，3]。现代研究表明九龙藤提取物具有抗炎镇痛、保护心脑血管、抗菌、抗病毒等药理作用[3-9]。我们前期以HPLC-Q-TOF/MS对九龙藤乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行了分析，发现主要为黄酮类和芳香酸类为主。为了进一步明确九龙藤的有效成分，我们采用HPLC-Q-TOF/MS追踪结合制备液相分离，快速分离鉴定了九龙藤乙酸乙酯部位中的多甲氧基黄酮类化合物，为九龙藤的药效物质筛选研究提供了简便、快速的样品制备方法。
一、材料与方法
1.仪器与试剂
Bruker Advance 600 MHz型核磁共振仪（德国Bruker公司）;安捷伦1260液相色谱仪，安捷伦四极杆串联飞行时间质谱仪6530（美国安捷伦公司）;）;Waters制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）;SK7210LHC数控超声波清洗器（功率350 W，频率53kHz，上海科导超声仪器有限公司）;EYELA N-1100旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）;九龙藤采于福建，鉴定为九龙藤Bauhinia championii Benth.;色谱甲醇（美国TEDIA公司）;试剂均为分析纯。
2.提取与分离
（1）提取
取九龙藤饮片1 kg，粉碎，以5倍量甲醇超声提取5次，合并提取液，减压浓缩后得总提取物141.2 g。取总提取物30 g，以500 ml蒸馏水混悬，分别以乙酸乙酯、正丁醇依次萃取（体积比1：1，萃取3次），将萃取液减壓浓缩后得到乙酸乙酯萃取物5.84g，正丁醇萃取物4.97g。
（2） HPLC-Q-TOF/MS追踪
Diamonsil C18 （2） 色谱柱（250×4.6mm ，5 μm）;以甲醇为A相，以0.1%甲酸-水为B相，梯度洗脱：0～18min，65% A;18～21min，65～95% A;21～25min，95%A;25～30 min，95～65 % A;30～35 min，65 % A;检测波长328 nm;柱温为30℃;进样量5 μL。质谱条件：ESI离子源，干燥气温度300 ℃，雾化气压力35 psi，干燥器流速8 L/min，鞘气温度350 ℃，鞘气流速11 L/min，毛细管电压3500 V（负离子），4000 V（正离子）;锥孔电压100 V;扫描范围m/z 100～1500;二级裂解电压15-35 eV。利用高分辨质谱的精确分子量、分子式以及二级质谱碎片数据，追踪九龙藤乙酸乙酯部位的多甲氧基黄酮类化合物。
（3）分离
采用制备型高效液相色谱，以YMC-Pack ODS-A-HG 色谱柱（250×10mm，S-10μm，12 nm），以甲醇-水（65%）为流动相进行分离，收集色谱峰馏分，得到化合物Ⅰ 5.4mg。
二、结果与讨论
我们利用HPLC-Q-TOF/MS分析，发现了九龙藤乙酸乙酯部位中的5个多甲氧基黄酮，以制备液相法摸索了最佳分离条件，分离了其中1个多甲氧基黄酮，其结构鉴定如下。
化合物Ⅰ：白色粉末。1H-NMR （CDCl3，600 MHz）：δ 7.51 （dd，1H，J = 8.4，2.5 Hz，H-6'），7.33（d，1H，J = 8.5Hz，H-5'），6.97（d，1H，J =2.5Hz，H-2'）， 6.80（s，1H，H-8）， 6.60（s，1H，H-3）， 3.99（s，7-OMe）， 3.98（s，6-OMe），3.96（s，5-OMe）， 3.92（s，4'-OMe）， 3.91（s，3'-OMe）。
高分辨质谱（HR-ESI-MS）给出准分子离子峰m/z 373.1287 [M+H]+，确定其分子式为C20H20O7，分子量为372，其二级质谱裂解碎片与5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮相同。以上波谱数据与文献报道[10，11]基本一致，因此确定化合物Ⅰ的结构为5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮。
我们通过HPLC-Q-TOF/MS追踪结合制备液相分离，快速分离鉴定了九龙藤乙酸乙酯部位中的多甲氧基黄酮类化合物，为九龙藤的药效物质筛选研究提供了简便、快速的样品制备方法。课题组将在后续研究中采用此法对九龙藤中特定结构类型的化合物进行针对性快速分离，并结合体内外活性研究，探讨九龙藤的药效物质基础，为九龙藤资源的开发利用提供理论依据。
本研究由浙江省大学生新苗人才计划项目（2020R425007），杭州医学院校级大学生创新创业训练计划项目S201913023021、S201913023022、S201913023041）资助。
参考文献
[1]《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编（上册）[M]. 北京：人民卫生出版社，1996：264-265.
[2]江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986：43.
关键词：九龙藤;多甲氧基黄酮;HPLC-MS/MS;分离鉴定
分类号：TQ461
九龙藤（Bauhinia championii Benth.） 为豆科羊蹄甲属植物，别名过岗龙、龙须藤、梅花入骨丹等，分布于浙江、广东、广西、福建等省[1]。九龙藤性苦、辛、平，无毒，具有祛风除湿、活血止痛、健脾理气等功效[2，3]。现代研究表明九龙藤提取物具有抗炎镇痛、保护心脑血管、抗菌、抗病毒等药理作用[3-9]。我们前期以HPLC-Q-TOF/MS对九龙藤乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行了分析，发现主要为黄酮类和芳香酸类为主。为了进一步明确九龙藤的有效成分，我们采用HPLC-Q-TOF/MS追踪结合制备液相分离，快速分离鉴定了九龙藤乙酸乙酯部位中的多甲氧基黄酮类化合物，为九龙藤的药效物质筛选研究提供了简便、快速的样品制备方法。
一、材料与方法
1.仪器与试剂
Bruker Advance 600 MHz型核磁共振仪（德国Bruker公司）;安捷伦1260液相色谱仪，安捷伦四极杆串联飞行时间质谱仪6530（美国安捷伦公司）;）;Waters制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）;SK7210LHC数控超声波清洗器（功率350 W，频率53kHz，上海科导超声仪器有限公司）;EYELA N-1100旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）;九龙藤采于福建，鉴定为九龙藤Bauhinia championii Benth.;色谱甲醇（美国TEDIA公司）;试剂均为分析纯。
2.提取与分离
（1）提取
取九龙藤饮片1 kg，粉碎，以5倍量甲醇超声提取5次，合并提取液，减压浓缩后得总提取物141.2 g。取总提取物30 g，以500 ml蒸馏水混悬，分别以乙酸乙酯、正丁醇依次萃取（体积比1：1，萃取3次），将萃取液减壓浓缩后得到乙酸乙酯萃取物5.84g，正丁醇萃取物4.97g。
（2） HPLC-Q-TOF/MS追踪
Diamonsil C18 （2） 色谱柱（250×4.6mm ，5 μm）;以甲醇为A相，以0.1%甲酸-水为B相，梯度洗脱：0～18min，65% A;18～21min，65～95% A;21～25min，95%A;25～30 min，95～65 % A;30～35 min，65 % A;检测波长328 nm;柱温为30℃;进样量5 μL。质谱条件：ESI离子源，干燥气温度300 ℃，雾化气压力35 psi，干燥器流速8 L/min，鞘气温度350 ℃，鞘气流速11 L/min，毛细管电压3500 V（负离子），4000 V（正离子）;锥孔电压100 V;扫描范围m/z 100～1500;二级裂解电压15-35 eV。利用高分辨质谱的精确分子量、分子式以及二级质谱碎片数据，追踪九龙藤乙酸乙酯部位的多甲氧基黄酮类化合物。
（3）分离
采用制备型高效液相色谱，以YMC-Pack ODS-A-HG 色谱柱（250×10mm，S-10μm，12 nm），以甲醇-水（65%）为流动相进行分离，收集色谱峰馏分，得到化合物Ⅰ 5.4mg。
二、结果与讨论
我们利用HPLC-Q-TOF/MS分析，发现了九龙藤乙酸乙酯部位中的5个多甲氧基黄酮，以制备液相法摸索了最佳分离条件，分离了其中1个多甲氧基黄酮，其结构鉴定如下。
化合物Ⅰ：白色粉末。1H-NMR （CDCl3，600 MHz）：δ 7.51 （dd，1H，J = 8.4，2.5 Hz，H-6'），7.33（d，1H，J = 8.5Hz，H-5'），6.97（d，1H，J =2.5Hz，H-2'）， 6.80（s，1H，H-8）， 6.60（s，1H，H-3）， 3.99（s，7-OMe）， 3.98（s，6-OMe），3.96（s，5-OMe）， 3.92（s，4'-OMe）， 3.91（s，3'-OMe）。
高分辨质谱（HR-ESI-MS）给出准分子离子峰m/z 373.1287 [M+H]+，确定其分子式为C20H20O7，分子量为372，其二级质谱裂解碎片与5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮相同。以上波谱数据与文献报道[10，11]基本一致，因此确定化合物Ⅰ的结构为5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮。
我们通过HPLC-Q-TOF/MS追踪结合制备液相分离，快速分离鉴定了九龙藤乙酸乙酯部位中的多甲氧基黄酮类化合物，为九龙藤的药效物质筛选研究提供了简便、快速的样品制备方法。课题组将在后续研究中采用此法对九龙藤中特定结构类型的化合物进行针对性快速分离，并结合体内外活性研究，探讨九龙藤的药效物质基础，为九龙藤资源的开发利用提供理论依据。
本研究由浙江省大学生新苗人才计划项目（2020R425007），杭州医学院校级大学生创新创业训练计划项目S201913023021、S201913023022、S201913023041）资助。
参考文献
[1]《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编（上册）[M]. 北京：人民卫生出版社，1996：264-265.
[2]江苏新医学院. 中药大辞典[M]. 上海：上海科学技术出版社，1986：43.