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【摘要】 目的 探讨环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)在人脑膜瘤中的表达及临床意义。方法 应用免疫组化SP法检测60例脑膜瘤中Ki-67、COX-2、E-cad蛋白的表达情况,原位杂交方法检测COX-2 mRNA、E-cadmRNA在脑膜瘤中的表达。结果 Ki-67、COX-2蛋白高表达和E-cad蛋白低表达与肿瘤组织学分级、侵袭性关系密切(P<0.05)。COX-2和E-cad表达呈负相关(P<0.05)。结论 COX-2和E-cad与脑膜瘤的病理分级、侵袭性密切相关,两者可能相互影响,共同调节脑膜瘤的侵袭性生长,联合检测COX-2和E-cad有助于判断脑膜瘤的生物学行为及预后。
【关键词】 脑膜瘤;环氧化酶-2;E-钙黏附素;免疫组织化学;原位杂交
Clinical significance and expression of cyclooxygenase-2 and E-cadherin in meningioma
WANG Min, LIU Kun, ZHOU Li,
et al.
Department of Pathology. The Second People’s Hospital of Liaocheng City, Affiliated to Taishan Medical College, Shandong, Liaocheng, 252600,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of cyclooxygenase-2(COX-2) and E-cadherin(E-cad) in meningioma and the clinical significance. Methods The expressions ofKi-67, COX-2 and E-cad were detected in 60 cases of meningioma by immunohistochemistry method, and the expressions of COX-2 mRNA、E-cadmRNA were examined by in situ hybridization. Results There was significant correlation between over-expression of Ki-67、COX-2 and decreased expression of E-cad with pathologic grade and invasion(P<0.05).There was negative correlation between the expression of COX-2 and E-cad(P<0.05).Conclusion Expressions of COX-2 and E-cad were significant correlated to pathologic grade and invasion. They may exert mutual
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.11.02
脑膜瘤是颅内常见的肿瘤,大多数为良性,约2%～10%为恶性。但良性脑膜瘤即使切除较彻底,仍有一定的复发率,其复发与肿瘤的侵袭性等因素有关。环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)是一种诱导型酶,可在多种因子刺激下产生,与多种肿瘤的细胞增殖、抗细胞凋亡和血管生成密切相关。E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)是一种广泛分布于上皮细胞的钙依赖性糖蛋白,主要介导同种细胞间的黏附连接反应,其异常表达在肿瘤的增殖、去分化、侵袭转移中起重要作用。本实验通过免疫组化、原位杂交的方法检测脑膜瘤中COX-2和E-cad的表达,探讨两者与脑膜瘤生物学行为和侵袭性的关系,为临床治疗和预后研究提供新思路。
1 材料和方法
1.1 临床资料 标本取自聊城市第二人民医院2006年1月至2010年8月手术切除的脑膜瘤标本60例,男13例,女47例,年龄17～77岁,平均(38.6±11.5)岁,术前均未接受化疗或放疗。术后病理根据2000年WHO分类标准:Ⅰ级40例,Ⅱ级12例,Ⅲ级8例。侵袭情况按照Ann等[1]方法分为:非侵袭组,肿瘤未侵犯周围组织;侵袭组,肿瘤侵犯脑组织、蛛网膜、颅骨、颅外软组织、颅内静脉窦。对照组10例正常脑膜组织来自颅脑外伤行内减压术的患者,且病检证实为非肿瘤组织。所有标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm连续切片。
1.2 试剂和方法
1.2.1 免疫组化SP法 COX-2和E-cad单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。SP免疫组化试剂盒购于福建迈新生物公司。实验步骤按试剂盒说明书进行。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,用已知阳性染色的切片作为阳性对照。1.2.2 原位杂交法 COX-2和E-cad原位杂交试剂盒购于武汉博士德生物公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行,DAB显色后苏木素复染,充分水洗。
1.3 阳性结果判定 COX-2和E-cad免疫组化染色以脑膜瘤细胞胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞,每例随机观察5个高倍视野(×400),肿瘤阳性细胞>5%为阳性表达,≤5%为阴性表达。
COX-2和E-cad原位杂交在脑膜瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性,每张切片随机取10个视野,显微镜下计数400个细胞,阳性细胞率达1%为阳性片(阳性细胞率=阳性细胞数/400×100%)。
1.4 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件包,计量资料采用多样本方差分析;计数资料采用χ2检验;两变量间相关性采用Spearman等级相关分析,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 COX-2、E-cad、Ki-67在脑膜瘤及正常脑膜组织中的表达 10例正常人脑膜组织中无COX-2表达,而在60例脑膜瘤中COX-2阳性表达率为43.3%(26/60),其差异有统计学意义(P<0.05)。脑膜瘤中COX-2的表达随病理分级的增高而增加(P<0.05)。但Ⅱ级脑膜瘤与Ⅲ级脑膜瘤中COX-2的表达差异无统计学意义(P>0.05)。侵袭组COX-2的表达高于非侵袭组,差异有统计学意义(P<0.05)。E-cad在脑膜瘤中的阳性表达率为71.7%(43/60),在正常脑膜组织中的表达为100%,两者差异有显著性(P<0.05)。随病理分级的增高,E-cad的表达率下降(P<0.05)。侵袭组E-cad的表达低于非侵袭组,差异有统计学意义(P<0.05)。在各组织中Ki-67标记指数,正常脑膜组织为0.3%,Ⅰ级脑膜瘤3.28%,Ⅱ级脑膜瘤9.36%,Ⅲ级脑膜瘤21.48%,均高于正常脑膜组织(P<0.05);侵袭组Ki-67LI高于非侵袭组,差异有显著性(表1)。
2.2 COX-2 mRNA、E-cadmRNA在脑膜瘤和正常脑膜组织的表达 正常脑膜组织和Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级脑膜瘤组织的COX-2 mRNA阳性表达率分别为0%、35%、66.7%、87.5%,各级脑膜瘤与正常脑膜组织比较,差异有统计学意义(P<0.05);COX-2 mRNA的表达率随恶性程度的增加而升高。但Ⅱ级脑膜瘤与Ⅲ级脑膜瘤中COX-2 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。侵袭组与非侵袭组比较,COX-2 mRNA阳性表达率增加(P<0.05)。E-cadmRNA在正常脑膜组织中表达率为100%,随恶性程度增加,其阳性表达率呈下降趋势,且与正常组比较差异有显著性。同样,侵袭组与非侵袭组比较,E-cadmRNA表达率下降(P<0.05)(表2)。
2.3 COX-2 mRNA与E-cadmRNA表达间的关系 采用Spearman等级相关分析发现,COX-2 mRNA与E-cadmRNA在脑膜瘤中的表达呈负相关(r=﹣0.926,P<0.05)。
3 讨论
环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)是各种内源性前列腺素合成过程中的限速酶。目前已知COX至少有两种同工酶:COX-1、COX-2。COX-2是诱导酶,除了在炎症中发挥重要作用外,还与多种肿瘤的细胞增殖、凋亡、细胞运动和肿瘤血管生成及肿瘤预后等密切相关[2]。本研究发现,COX-2蛋白和COX-2 mRNA在正常脑膜组织中无表达,在脑膜瘤组织中的表达显著增加,且随着肿瘤恶性程度的增高,表达越明显。从蛋白合成和基因转录两个水平提示COX-2可能在脑膜瘤的发生、发展过程中起重要作用。Buccoliero[3]通过免疫组化、RT-PCR技术检测COX-2的表达,本结果与其相似。此外,侵袭组COX-2蛋白和COX-2 mRNA的表达率比非侵袭组高,提示COX-2在脑膜瘤侵袭过程中也发挥作用,可作为其复发、侵袭及预后的敏感指标之一。COX-2在恶性肿瘤的浸润,转移中发挥作用,可能还与其改变细胞表型,增加肿瘤细胞表达与侵袭,转移相关的细胞因子如钙黏素[4]、MMP-2等有关。非甾体抗炎药塞来昔布(Celecoxib)为特异性COX-2抑制剂,Ragel等[5,6]研究塞来昔布对体外脑膜瘤细胞增殖、COX-2蛋白表达的影响,发现塞来昔布以浓度依赖性的方式抑制脑膜瘤细胞的生长,还可以诱导细胞凋亡。因此,提出塞来昔布在脑膜瘤,尤其在对放化疗不敏感,复发的病例中发挥重要作用。
E-cad是上皮钙依赖黏附素,分布于成人的上皮细胞中,为介导同质型黏附的黏附分子,有研究证实E-cad阳性表达的肿瘤细胞黏附能力强于阴性者,E-cad活性减弱可引起细胞与细胞间黏附力下降。本研究发现侵袭组中E-cad、E-cadmRNA的表达明显弱于非侵袭组,说明E-cad表达下降或缺失,使脑膜瘤细胞间的黏附力减弱,肿瘤细胞容易分散而向外浸润性生长。同时,在10例正常脑膜组织中E-cad、E-cadmRNA呈强阳性表达,而60例脑膜瘤中E-cad的表达缺失率为28.3%,差异有统计学意义。且各级脑膜瘤相比,E-cad、E-cadmRNA的表达逐渐降低。说明E-cad在脑膜瘤的发生、发展过程中发挥作用,此结果与K Zhou等[7]实验结果一致。研究发现脑膜瘤的发生与人22号染色体的缺失有密切关系,包括NF2杂合子丢失,NF2编码蛋白merlin为一种肿瘤抑制基因,通过调节钙黏蛋白调节细胞之间的黏附作用。E-cad在脑膜瘤中表达减弱或缺失,可能与NF2的缺失有关。此外,Pecina-Slaus等[8]PCR检测E-cad基因不稳定性发现,错配修复可能在脑膜瘤的发生、发展中发挥作用。
同时检测COX-2和E-cad在脑膜瘤中的表达及两者的相关性,国内报道较少,本研究发现COX-2和E-cad表达存在负相关关系,两者之间有很好的依从性。COX-2可能与APC基因关联,并相互调控。而APC基因产物又与E-cad的配体β-连环素相关联。通过APC为中介,调节两者之间的表达。COX-2的表达上调和E-cad的表达下调将促进肿瘤细胞发生转移和侵袭并向恶性方向的发展,因此,选择性COX-2抑制剂和E-cad调节剂将成为抗肿瘤治疗的新靶点,同时靶向COX-2和E-cad是否更具有治疗优势尚待进一步研究。
参考文献
[1] Perret AG, Duthel R, Fotso MJ et al. Stromelysin-3 is expressed by aggressive meningiomas.Cancer,2002,94(3):765-772.
[2] M oran EM. Epidemiological and clinical aspects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and cancer risks.J Envion Pathol Toxicol Oncol,2002,21(2):193-201.
[3] Buccoliero AM, Castiglione F, Degl’Innocenti DR, et al. Cyclooxygenase-2 (COX-2) overexpression in meningiomas: real time PCR and immunohistochemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007,15(2):187-192.
[4] Dohadwala M, Yang SC, Luo J, et al. Cyclooxygenase-2-dependent regulation of E-cadherin: prostaglandin E(2)in duces transcriptional repressors ZEB 1 and snail in non-small cell lung cancer.Cancer Res,2006,66(10):5338-5345.
[5] Ragel BT, Jensen RL, Couldwell WT, et al. Inflammatory response and meningioma tumorigenesis and the effect of cyclooxygenase-2 inhibitors. Neurosurg Focus,2007,23(4):E7.
[6] Ragel BT, Jensen RL, Gillespie DL,et al. Ubiquitous expression of cyclooxygenase-2 in meningiomas and decrease in cell growth following in vitro treatment with the inhibitor celecoxib: potential therapeutic application. J Neurosurg, 2005,103(3):508-517.
[7] Zhou K, Wang G, Wang Y, et al. The potential involvement of E-cadherin and beta-catenins in meningioma. PLoS One,2010, 5(6):11231.
[8] Pe?ina-Slaus N, Nikuseva Marti T, Deak AJ,et al. Genetic and protein changes of E-cadherin in meningiomas. J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(5):695-702.
【关键词】 脑膜瘤;环氧化酶-2;E-钙黏附素;免疫组织化学;原位杂交
Clinical significance and expression of cyclooxygenase-2 and E-cadherin in meningioma
WANG Min, LIU Kun, ZHOU Li,
et al.
Department of Pathology. The Second People’s Hospital of Liaocheng City, Affiliated to Taishan Medical College, Shandong, Liaocheng, 252600,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of cyclooxygenase-2(COX-2) and E-cadherin(E-cad) in meningioma and the clinical significance. Methods The expressions ofKi-67, COX-2 and E-cad were detected in 60 cases of meningioma by immunohistochemistry method, and the expressions of COX-2 mRNA、E-cadmRNA were examined by in situ hybridization. Results There was significant correlation between over-expression of Ki-67、COX-2 and decreased expression of E-cad with pathologic grade and invasion(P<0.05).There was negative correlation between the expression of COX-2 and E-cad(P<0.05).Conclusion Expressions of COX-2 and E-cad were significant correlated to pathologic grade and invasion. They may exert mutual
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.11.02
脑膜瘤是颅内常见的肿瘤,大多数为良性,约2%～10%为恶性。但良性脑膜瘤即使切除较彻底,仍有一定的复发率,其复发与肿瘤的侵袭性等因素有关。环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)是一种诱导型酶,可在多种因子刺激下产生,与多种肿瘤的细胞增殖、抗细胞凋亡和血管生成密切相关。E-钙黏附素(E-cadherin,E-cad)是一种广泛分布于上皮细胞的钙依赖性糖蛋白,主要介导同种细胞间的黏附连接反应,其异常表达在肿瘤的增殖、去分化、侵袭转移中起重要作用。本实验通过免疫组化、原位杂交的方法检测脑膜瘤中COX-2和E-cad的表达,探讨两者与脑膜瘤生物学行为和侵袭性的关系,为临床治疗和预后研究提供新思路。
1 材料和方法
1.1 临床资料 标本取自聊城市第二人民医院2006年1月至2010年8月手术切除的脑膜瘤标本60例,男13例,女47例,年龄17～77岁,平均(38.6±11.5)岁,术前均未接受化疗或放疗。术后病理根据2000年WHO分类标准:Ⅰ级40例,Ⅱ级12例,Ⅲ级8例。侵袭情况按照Ann等[1]方法分为:非侵袭组,肿瘤未侵犯周围组织;侵袭组,肿瘤侵犯脑组织、蛛网膜、颅骨、颅外软组织、颅内静脉窦。对照组10例正常脑膜组织来自颅脑外伤行内减压术的患者,且病检证实为非肿瘤组织。所有标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm连续切片。
1.2 试剂和方法
1.2.1 免疫组化SP法 COX-2和E-cad单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。SP免疫组化试剂盒购于福建迈新生物公司。实验步骤按试剂盒说明书进行。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,用已知阳性染色的切片作为阳性对照。1.2.2 原位杂交法 COX-2和E-cad原位杂交试剂盒购于武汉博士德生物公司。实验步骤严格按试剂盒说明书进行,DAB显色后苏木素复染,充分水洗。
1.3 阳性结果判定 COX-2和E-cad免疫组化染色以脑膜瘤细胞胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞,每例随机观察5个高倍视野(×400),肿瘤阳性细胞>5%为阳性表达,≤5%为阴性表达。
COX-2和E-cad原位杂交在脑膜瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性,每张切片随机取10个视野,显微镜下计数400个细胞,阳性细胞率达1%为阳性片(阳性细胞率=阳性细胞数/400×100%)。
1.4 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件包,计量资料采用多样本方差分析;计数资料采用χ2检验;两变量间相关性采用Spearman等级相关分析,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 COX-2、E-cad、Ki-67在脑膜瘤及正常脑膜组织中的表达 10例正常人脑膜组织中无COX-2表达,而在60例脑膜瘤中COX-2阳性表达率为43.3%(26/60),其差异有统计学意义(P<0.05)。脑膜瘤中COX-2的表达随病理分级的增高而增加(P<0.05)。但Ⅱ级脑膜瘤与Ⅲ级脑膜瘤中COX-2的表达差异无统计学意义(P>0.05)。侵袭组COX-2的表达高于非侵袭组,差异有统计学意义(P<0.05)。E-cad在脑膜瘤中的阳性表达率为71.7%(43/60),在正常脑膜组织中的表达为100%,两者差异有显著性(P<0.05)。随病理分级的增高,E-cad的表达率下降(P<0.05)。侵袭组E-cad的表达低于非侵袭组,差异有统计学意义(P<0.05)。在各组织中Ki-67标记指数,正常脑膜组织为0.3%,Ⅰ级脑膜瘤3.28%,Ⅱ级脑膜瘤9.36%,Ⅲ级脑膜瘤21.48%,均高于正常脑膜组织(P<0.05);侵袭组Ki-67LI高于非侵袭组,差异有显著性(表1)。
2.2 COX-2 mRNA、E-cadmRNA在脑膜瘤和正常脑膜组织的表达 正常脑膜组织和Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级脑膜瘤组织的COX-2 mRNA阳性表达率分别为0%、35%、66.7%、87.5%,各级脑膜瘤与正常脑膜组织比较,差异有统计学意义(P<0.05);COX-2 mRNA的表达率随恶性程度的增加而升高。但Ⅱ级脑膜瘤与Ⅲ级脑膜瘤中COX-2 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。侵袭组与非侵袭组比较,COX-2 mRNA阳性表达率增加(P<0.05)。E-cadmRNA在正常脑膜组织中表达率为100%,随恶性程度增加,其阳性表达率呈下降趋势,且与正常组比较差异有显著性。同样,侵袭组与非侵袭组比较,E-cadmRNA表达率下降(P<0.05)(表2)。
2.3 COX-2 mRNA与E-cadmRNA表达间的关系 采用Spearman等级相关分析发现,COX-2 mRNA与E-cadmRNA在脑膜瘤中的表达呈负相关(r=﹣0.926,P<0.05)。
3 讨论
环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)是各种内源性前列腺素合成过程中的限速酶。目前已知COX至少有两种同工酶:COX-1、COX-2。COX-2是诱导酶,除了在炎症中发挥重要作用外,还与多种肿瘤的细胞增殖、凋亡、细胞运动和肿瘤血管生成及肿瘤预后等密切相关[2]。本研究发现,COX-2蛋白和COX-2 mRNA在正常脑膜组织中无表达,在脑膜瘤组织中的表达显著增加,且随着肿瘤恶性程度的增高,表达越明显。从蛋白合成和基因转录两个水平提示COX-2可能在脑膜瘤的发生、发展过程中起重要作用。Buccoliero[3]通过免疫组化、RT-PCR技术检测COX-2的表达,本结果与其相似。此外,侵袭组COX-2蛋白和COX-2 mRNA的表达率比非侵袭组高,提示COX-2在脑膜瘤侵袭过程中也发挥作用,可作为其复发、侵袭及预后的敏感指标之一。COX-2在恶性肿瘤的浸润,转移中发挥作用,可能还与其改变细胞表型,增加肿瘤细胞表达与侵袭,转移相关的细胞因子如钙黏素[4]、MMP-2等有关。非甾体抗炎药塞来昔布(Celecoxib)为特异性COX-2抑制剂,Ragel等[5,6]研究塞来昔布对体外脑膜瘤细胞增殖、COX-2蛋白表达的影响,发现塞来昔布以浓度依赖性的方式抑制脑膜瘤细胞的生长,还可以诱导细胞凋亡。因此,提出塞来昔布在脑膜瘤,尤其在对放化疗不敏感,复发的病例中发挥重要作用。
E-cad是上皮钙依赖黏附素,分布于成人的上皮细胞中,为介导同质型黏附的黏附分子,有研究证实E-cad阳性表达的肿瘤细胞黏附能力强于阴性者,E-cad活性减弱可引起细胞与细胞间黏附力下降。本研究发现侵袭组中E-cad、E-cadmRNA的表达明显弱于非侵袭组,说明E-cad表达下降或缺失,使脑膜瘤细胞间的黏附力减弱,肿瘤细胞容易分散而向外浸润性生长。同时,在10例正常脑膜组织中E-cad、E-cadmRNA呈强阳性表达,而60例脑膜瘤中E-cad的表达缺失率为28.3%,差异有统计学意义。且各级脑膜瘤相比,E-cad、E-cadmRNA的表达逐渐降低。说明E-cad在脑膜瘤的发生、发展过程中发挥作用,此结果与K Zhou等[7]实验结果一致。研究发现脑膜瘤的发生与人22号染色体的缺失有密切关系,包括NF2杂合子丢失,NF2编码蛋白merlin为一种肿瘤抑制基因,通过调节钙黏蛋白调节细胞之间的黏附作用。E-cad在脑膜瘤中表达减弱或缺失,可能与NF2的缺失有关。此外,Pecina-Slaus等[8]PCR检测E-cad基因不稳定性发现,错配修复可能在脑膜瘤的发生、发展中发挥作用。
同时检测COX-2和E-cad在脑膜瘤中的表达及两者的相关性,国内报道较少,本研究发现COX-2和E-cad表达存在负相关关系,两者之间有很好的依从性。COX-2可能与APC基因关联,并相互调控。而APC基因产物又与E-cad的配体β-连环素相关联。通过APC为中介,调节两者之间的表达。COX-2的表达上调和E-cad的表达下调将促进肿瘤细胞发生转移和侵袭并向恶性方向的发展,因此,选择性COX-2抑制剂和E-cad调节剂将成为抗肿瘤治疗的新靶点,同时靶向COX-2和E-cad是否更具有治疗优势尚待进一步研究。
参考文献
[1] Perret AG, Duthel R, Fotso MJ et al. Stromelysin-3 is expressed by aggressive meningiomas.Cancer,2002,94(3):765-772.
[2] M oran EM. Epidemiological and clinical aspects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and cancer risks.J Envion Pathol Toxicol Oncol,2002,21(2):193-201.
[3] Buccoliero AM, Castiglione F, Degl’Innocenti DR, et al. Cyclooxygenase-2 (COX-2) overexpression in meningiomas: real time PCR and immunohistochemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007,15(2):187-192.
[4] Dohadwala M, Yang SC, Luo J, et al. Cyclooxygenase-2-dependent regulation of E-cadherin: prostaglandin E(2)in duces transcriptional repressors ZEB 1 and snail in non-small cell lung cancer.Cancer Res,2006,66(10):5338-5345.
[5] Ragel BT, Jensen RL, Couldwell WT, et al. Inflammatory response and meningioma tumorigenesis and the effect of cyclooxygenase-2 inhibitors. Neurosurg Focus,2007,23(4):E7.
[6] Ragel BT, Jensen RL, Gillespie DL,et al. Ubiquitous expression of cyclooxygenase-2 in meningiomas and decrease in cell growth following in vitro treatment with the inhibitor celecoxib: potential therapeutic application. J Neurosurg, 2005,103(3):508-517.
[7] Zhou K, Wang G, Wang Y, et al. The potential involvement of E-cadherin and beta-catenins in meningioma. PLoS One,2010, 5(6):11231.
[8] Pe?ina-Slaus N, Nikuseva Marti T, Deak AJ,et al. Genetic and protein changes of E-cadherin in meningiomas. J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(5):695-702.