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[摘要] 目的 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2，并在真核细胞HEK293T细胞中表达，为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础。方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因，连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中，构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒。通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染。Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况。结果 经Realtime-PCR及Westernblot方法，证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达。结论 成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒，并能在HEK293T细胞中表达，为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础。
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1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培养液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行分离电泳（200 V，40 min），然后将分离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉封闭NC膜0.5 h，分别加入Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，最终漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。
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