【摘 要】
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目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9,Cas9）系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1（interferon alpha/beta receptor subunit 1,I
【基金项目】
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国家重点研发计划（2021YFC2301000）；
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目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated protein 9,Cas9）系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1（interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1）基因，构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法 利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA（single guide RNA）序列，构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒，慢病毒包装后感染Caco-2细胞，嘌呤霉素抗性筛选，有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况；通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10（CXC chemokine ligand 10,CXCL10）和干扰素刺激基因20（interferon-stimulatd gene 20,ISG20）mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株，测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失，Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失，同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比，Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ，在50 ng/mL外源IFNβ刺激下，Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平（t分别为0.566和1.268,P＞0.05）和ISG20基因mRNA水平（t分别为1.522和1.733,P＞0.05）均无明显升高；与野生型Caco-2细胞相比，在50 ng/mL外源IFNβ刺激下，Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平（t分别为6.763和6.777,P＜0.05）和ISG20基因mRNA水平（t分别为5.664和5.653,P＜0.05）均显著降低。结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株，该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体（interferon alpha/beta receptor,IFNAR）激活的下游分子被明显抑制，为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。
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