目的 探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)表达质粒在大鼠肝星形细胞(HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响.方法双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC,培养7～10 d后活化为肌成纤维样母细胞表型.应用巢式RT-PCR和基因重组技术构建能在真核细胞中表达的反义TIMP-1质粒并测序鉴定.应用脂质体介导重组质粒和pcDNA3空质粒转染HSC,经含400 μg/ml G418的DMEM培养液筛选3～4周,另设立空白对照组.Northern blot和Western blot检测筛选后的HSC中TIMP-1表达情况;用FITC标记的Ⅰ型胶原为底物测定培养上清液内间质胶原酶活性;应用Western blot方法对HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原进行半定量分析.结果外源重组质粒能较大程度地抑制活化HSC中TIMP-1的表达,而pcDNA3空质粒和空白对照组则无类似结果.TIMP-1/GAPDH比值分别为0.67,2.41和2.97(mRNA水平,P＜0.05).TIMP-1/β-actin比值分别为0.31,0 98和1.32(蛋白质水平,P＜0.05).外源重组质粒转染显著提高了间质胶原酶活性,酶活性分别为0.3049,0.1411和0.1196(P＜0.05).HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量明显减少.Ⅰ型胶原/β-actin比值分别为0.63,1.78和1.92(P＜0.05).Ⅲ型胶原/β-actin比值分别为0.59,1.81和1.98(P＜0.05).结论反义TIMP-1重组质粒可在HSC中获得稳定表达,并可大幅提高HSC培养液中间质胶原酶的活性,这就有可能提高对Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解能力,减少HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,从而减少了以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(ECM)过度沉积,为肝纤维化的逆转提供一个新的思路和方法。
反义金属蛋白酶抑制因子-1对肝星形细胞的影响
【摘 要】
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目的 探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)表达质粒在大鼠肝星形细胞(HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响.方法双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC,培养7～10 d后活化为肌成纤维样母细胞表型.应用巢式RT-PCR和基因重组技术构建能在真核细胞中表达的反义TIMP-1质粒并测序鉴定.应用脂质体介导重组质粒和pcDNA3空质粒转染HSC,经含400 μg/m
【机 构】
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200032,上海,复旦大学附属中山医院消化科,200032,上海,复旦大学附属中山医院消化科,200032,上海,复旦大学附属中山医院消化科,200032,上海,复旦大学附属中山医院消化科,2000
【出 处】
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中华消化杂志
【发表日期】
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2004年24期
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