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【摘 要】米曲霉菌种蛋白酶活力对酱油发酵阶段出油至关重要，成曲的酶活力强，有利于提高原料的利用率，促进制曲和发酵阶段的分解作用。但在生产中三角瓶种中性蛋白酶活力不稳定，给生产原料利用率带来了损失。本实验从三个方面研究对中性蛋白酶活力的影响。
【关键词】米曲霉；中性蛋白酶活力；斜面菌种；三角瓶菌种；孢子数
0.引言
酱油是原料经蒸熟冷却，接入纯粹培养的米曲霉菌种制成酱曲，酱曲移入发酵池，加盐水发酵，待酱醅成熟后，以浸出法提取酱油。制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长发育，并大量产生和积蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。在发酵过程中味的形成是利用這些酶的作用。如蛋白酶及肽酶将蛋白质水解为氨基酸，产生鲜味；谷氨酰胺酶把无味的谷氨酰胺变成具有鲜味的俗谷氨酸；淀粉酶将淀份水解成糖，产生甜味；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等能将细胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更彻底[1]。本实验的目的就是在三角瓶阶段获得大量的纯菌种，菌丝发育健壮，产酶能力强、孢子数量多、孢子的耐久性强、发芽率高，为种曲提供优良的种子。
1.实验材料与方法
1.1实验材料、仪器、培养条件
1.1.1 实验材料
斜面菌种、麦糠、米粕、小麦面粉、500ml三角瓶、孢子数。
1.1.2实验仪器
电子分析天平（0.1mg）（A&D）；721分光光度计（河南兄弟仪器设备有限公司）；水浴锅（北京市永光明医疗器械）；微量可调移液枪（Finnpiptte）；血球计数板（上海医乐医用光学仪器厂）
1.1.3培养条件
接完种后，在培养室28-300C培养，72小时成曲。
1.2实验方法
1.2.1实验设计
本实验采用四种实验方案：
（1）不同斜面菌种实验：用不同的煮豆方法煮出的豆汁配制斜面进行斜面接种，待斜面成熟后进行感官检验和发芽率实验，剔除不合格斜面。然后用合格斜面接种三角瓶，放在培养室28-30°C培养。做成曲的的孢子数和蛋白酶活力的测定。
（2）三角瓶种配方实验：麦糠、米粕、面粉按照一定比例配制，加总量的93%的水，待放置30分钟过后进行搅拌分料，灭菌接种培养28-30°C，72小时成曲。测成曲的孢子数和中性蛋白酶活力。
（3）三角瓶种量实验：用基础配方麦糠：米粕：面粉=75：17：8，加水量93%，不同接种量，培养28-30°C，72小时成曲。测成曲的孢子数和中性蛋白酶活力。
1.2.2中性蛋白酶活力测定方法
取试管两只，每只试管加入样品稀释液1ml，置于40度水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5ml，精确保温10min。时间到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以终止反应。继续水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。
空白实验2测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。
计算：在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力单位=ΔA/10× 11×K×N
K：常数，吸光度为1时蛋白酶活力单位，由酪氨酸标准曲线得出；
N：为稀释倍数。
1.2.3孢子数的测定[2]
取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。 用高倍镜头观察四个角上的4个中格（即100个小格）的孢子数。
16×25的计数板
孢子数（个/g）=（N/100） ×400×10000×（V/G）=4×104×（NV/G）…… （1）
式中N—100小格内孢子总数（个）；
V—孢子稀释液体积（ml）；
G—样品重量（g）。
2.结果与讨论
2.1不同斜面菌种对三角瓶种中性蛋白酶活力的影响
表一
备注：斜面I3和J为旧的煮豆方法，斜面I1 和J1为新的煮豆方法；I1和I3、J1和J3为同一个斜面。
结论：从以上数据可以看出，煮豆方法的改变所配制的斜面菌种对三角瓶种成曲中性蛋白酶活力影响不大；孢子数多的菌种蛋白酶活力高。
2.2 不同培养基配方对三角瓶种中性蛋白酶活力的影响
表二
（备注：第一次实验所用斜面批号为A060217-2G；第二、三次实验所用斜面批号均为A060223-I1和A060223-I3。配方一、配方五与配方六生长较快。）
结论：合适的碳氮比可以提高三角瓶种中性蛋白酶活力，孢子数多的斜面其三角瓶成曲中性蛋白酶活力高；再次证明孢子数多的菌种蛋白酶活力高。
2.3不同接种量对三角瓶种中性蛋白酶活力的影响
表三
（备注：本次实验所用斜面批号为A060227-2K。）
结论：从以上实验可以看出，合适的接种量可以提高菌种的蛋白酶活力。接种量太少，菌种生长所需的营养物质充足，容易出现气生菌丝；接种量太大，菌种生长所需的营养物质不够，对菌种的生长造成影响，蛋白酶活力低。
3.结论
实验结果表明：
（1）不同的煮豆方法配制的斜面对三角瓶种中性蛋白酶活力影响不大。制作斜面用的培养基主要是豆汁，添加一些微量元素。从实验中可以看出，煮豆方法的改变并没有改变豆汁中营养素的改变和一些糖类的改变。
（2）培养基配方的改变对三角瓶种中性蛋白酶活力影响较大。我们添加米粕、麦糠主要目的是提供菌种生长所需的碳源和氮源和微量元素、无机盐。氨基酸等。而且麦糠质地疏松，表面积大，营养成分适于促进米曲霉的生长和产酶。
（3）适当的接种量可以提高成曲蛋白酶活力。接种量太大，生长所需的各种营养物质缺乏，导致成曲色泽不均，孢子数较少，包子发芽率低；接种量低，菌种生长营养物质过于旺盛，再生菌丝过多，成曲长白毛结块严重，造成成曲孢子数、发芽率、蛋白酶活力低。我们在生产中要严格把控三角瓶中的质量，发现成曲质量低要严格去掉，不能用于生产。
（4）孢子数影响蛋白酶活力。孢子数多的成曲蛋白酶活力相应增高。
（5）从表二和表三种可以看出，适当提高培养基的加水量，可以提高成曲蛋白酶活力。水分适当，不仅对包子发芽有利，而且为以后产酶多、酶活性强创造了条件。
【参考文献】
[1]董胜利，徐开生.酿造调味品生产技术.2003.
[2]天津轻工业学院，大连轻工业学院，无锡轻工业学院，华南工学院汇编.食品发酵分析.1980.
[3]天津轻工业学院，无锡轻工业大学合编.食品微生物学.1980.
【关键词】米曲霉；中性蛋白酶活力；斜面菌种；三角瓶菌种；孢子数
0.引言
酱油是原料经蒸熟冷却，接入纯粹培养的米曲霉菌种制成酱曲，酱曲移入发酵池，加盐水发酵，待酱醅成熟后，以浸出法提取酱油。制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长发育，并大量产生和积蓄所需要的酶，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。在发酵过程中味的形成是利用這些酶的作用。如蛋白酶及肽酶将蛋白质水解为氨基酸，产生鲜味；谷氨酰胺酶把无味的谷氨酰胺变成具有鲜味的俗谷氨酸；淀粉酶将淀份水解成糖，产生甜味；果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等能将细胞壁完全破裂，使蛋白酶和淀粉酶水解等更彻底[1]。本实验的目的就是在三角瓶阶段获得大量的纯菌种，菌丝发育健壮，产酶能力强、孢子数量多、孢子的耐久性强、发芽率高，为种曲提供优良的种子。
1.实验材料与方法
1.1实验材料、仪器、培养条件
1.1.1 实验材料
斜面菌种、麦糠、米粕、小麦面粉、500ml三角瓶、孢子数。
1.1.2实验仪器
电子分析天平（0.1mg）（A&D）；721分光光度计（河南兄弟仪器设备有限公司）；水浴锅（北京市永光明医疗器械）；微量可调移液枪（Finnpiptte）；血球计数板（上海医乐医用光学仪器厂）
1.1.3培养条件
接完种后，在培养室28-300C培养，72小时成曲。
1.2实验方法
1.2.1实验设计
本实验采用四种实验方案：
（1）不同斜面菌种实验：用不同的煮豆方法煮出的豆汁配制斜面进行斜面接种，待斜面成熟后进行感官检验和发芽率实验，剔除不合格斜面。然后用合格斜面接种三角瓶，放在培养室28-30°C培养。做成曲的的孢子数和蛋白酶活力的测定。
（2）三角瓶种配方实验：麦糠、米粕、面粉按照一定比例配制，加总量的93%的水，待放置30分钟过后进行搅拌分料，灭菌接种培养28-30°C，72小时成曲。测成曲的孢子数和中性蛋白酶活力。
（3）三角瓶种量实验：用基础配方麦糠：米粕：面粉=75：17：8，加水量93%，不同接种量，培养28-30°C，72小时成曲。测成曲的孢子数和中性蛋白酶活力。
1.2.2中性蛋白酶活力测定方法
取试管两只，每只试管加入样品稀释液1ml，置于40度水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5ml，精确保温10min。时间到后，各管立即加入0.4mol/L三氯醋酸5ml，以终止反应。继续水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。取滤液用751分光光度计在275nm处测定其吸收度。
空白实验2测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯醋酸5ml，使酶失活，在加酪蛋白。
计算：在40度下每1min水解酪蛋白产生1Ug酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力单位=ΔA/10× 11×K×N
K：常数，吸光度为1时蛋白酶活力单位，由酪氨酸标准曲线得出；
N：为稀释倍数。
1.2.3孢子数的测定[2]
取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。 用高倍镜头观察四个角上的4个中格（即100个小格）的孢子数。
16×25的计数板
孢子数（个/g）=（N/100） ×400×10000×（V/G）=4×104×（NV/G）…… （1）
式中N—100小格内孢子总数（个）；
V—孢子稀释液体积（ml）；
G—样品重量（g）。
2.结果与讨论
2.1不同斜面菌种对三角瓶种中性蛋白酶活力的影响
表一
备注：斜面I3和J为旧的煮豆方法，斜面I1 和J1为新的煮豆方法；I1和I3、J1和J3为同一个斜面。
结论：从以上数据可以看出，煮豆方法的改变所配制的斜面菌种对三角瓶种成曲中性蛋白酶活力影响不大；孢子数多的菌种蛋白酶活力高。
2.2 不同培养基配方对三角瓶种中性蛋白酶活力的影响
表二
（备注：第一次实验所用斜面批号为A060217-2G；第二、三次实验所用斜面批号均为A060223-I1和A060223-I3。配方一、配方五与配方六生长较快。）
结论：合适的碳氮比可以提高三角瓶种中性蛋白酶活力，孢子数多的斜面其三角瓶成曲中性蛋白酶活力高；再次证明孢子数多的菌种蛋白酶活力高。
2.3不同接种量对三角瓶种中性蛋白酶活力的影响
表三
（备注：本次实验所用斜面批号为A060227-2K。）
结论：从以上实验可以看出，合适的接种量可以提高菌种的蛋白酶活力。接种量太少，菌种生长所需的营养物质充足，容易出现气生菌丝；接种量太大，菌种生长所需的营养物质不够，对菌种的生长造成影响，蛋白酶活力低。
3.结论
实验结果表明：
（1）不同的煮豆方法配制的斜面对三角瓶种中性蛋白酶活力影响不大。制作斜面用的培养基主要是豆汁，添加一些微量元素。从实验中可以看出，煮豆方法的改变并没有改变豆汁中营养素的改变和一些糖类的改变。
（2）培养基配方的改变对三角瓶种中性蛋白酶活力影响较大。我们添加米粕、麦糠主要目的是提供菌种生长所需的碳源和氮源和微量元素、无机盐。氨基酸等。而且麦糠质地疏松，表面积大，营养成分适于促进米曲霉的生长和产酶。
（3）适当的接种量可以提高成曲蛋白酶活力。接种量太大，生长所需的各种营养物质缺乏，导致成曲色泽不均，孢子数较少，包子发芽率低；接种量低，菌种生长营养物质过于旺盛，再生菌丝过多，成曲长白毛结块严重，造成成曲孢子数、发芽率、蛋白酶活力低。我们在生产中要严格把控三角瓶中的质量，发现成曲质量低要严格去掉，不能用于生产。
（4）孢子数影响蛋白酶活力。孢子数多的成曲蛋白酶活力相应增高。
（5）从表二和表三种可以看出，适当提高培养基的加水量，可以提高成曲蛋白酶活力。水分适当，不仅对包子发芽有利，而且为以后产酶多、酶活性强创造了条件。
【参考文献】
[1]董胜利，徐开生.酿造调味品生产技术.2003.
[2]天津轻工业学院，大连轻工业学院，无锡轻工业学院，华南工学院汇编.食品发酵分析.1980.
[3]天津轻工业学院，无锡轻工业大学合编.食品微生物学.1980.