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基金项目：江苏省高校面上项目（项目编号：19KJ360017、20KJB550014）;国家级大学生创新创业训练计划（项目编号：201910315034Z）;南京中医药大学中药学一流学科开放课题（项目编号：2020YLXK021）。
作者简介：赵琳（1999—），女，在读硕士研究生，研究方向：生物发酵与转化。
通信作者：张森（1988—），男，副教授，研究方向：工业微生物。
摘要：目的：研究嗜酸乳杆菌LA85对小鼠免疫机能的影响。方法：将160只雄性小鼠随机分为4组，即对照组、低、中、高三个剂量组。采用灌胃的方式给予实验小鼠不同剂量的嗜酸乳杆菌LA85。通过对小鼠平均体重、脾脏和胸腺免疫指数、细胞免疫、体液免疫、单核-吞噬性细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）活性的评价，探讨嗜酸乳杆菌LA85对小鼠免疫机能的影响机制。结果：与对照组相比，嗜酸乳杆菌LA85低、中、高剂量组能够显著提升小鼠的胸腺指数，嗜酸乳杆菌LA85高剂量组能够显著提升小鼠的脾脏指数。同时能够显著提高小鼠的淋巴细胞增殖分化能力、半数溶血值、巨噬细胞的吞噬能力、NK细胞的细胞活性;嗜酸乳杆菌对小鼠的体重没有影响。结论：给予小鼠口服嗜酸乳杆菌LA85可以通过改善细胞免疫和体液免疫功能，从而提高免疫力。
关键词：嗜酸乳杆菌LA85;免疫机能;小鼠
益生菌是当宿主摄入一定量时，能够通过调节肠道菌群的平衡来维持宿主消化系统和肠道健康的一类微生物[1-2]。乳酸菌作为一种益生菌，对人类的一些疾病，如炎症性肠疾病、肠功能障碍和结肠癌等起到预防和治疗的效果，同时对人体免疫功能也有一定的增强作用[3-6]。乳酸菌细胞通过对食道肠黏膜上皮巨噬细胞和其他宿主黏膜的免疫黏附作用进入人体肠道，刺激机体的免疫系统，通过免疫调节趋化因子和巨噬细胞因子的产生，达到不断增强机体宿主黏膜免疫能力的重要作用[7-8]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属于革兰氏阳性菌，其在机体内可以释放乙酸和乳酸等物质，从而起到抑制有害微生物生长的作用，继而发挥调节肠道菌群平衡的功能[9-10]。谢文惠[11]研究表明，含嗜酸乳杆菌的复合益生菌制剂在一定程度上提高了肉鸡血清中免疫球蛋白含量，从而增强肉鸡机体免疫性能。本实验使用嗜酸乳杆菌LA85饲喂健康小鼠，以小鼠体重、免疫器官指数，以及细胞免疫和体液免疫等相关参数为评价指标[12-14]，探讨嗜酸乳杆菌对小鼠免疫能力的影响，为进一步研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料、试剂及实验动物
SPF级，ICR小鼠，雄性，8 w龄，初始体重18～22 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司;清洁级颗粒鼠粮和清洁级垫料，购自江苏协同医药生物工程有限公司。
嗜酸乳杆菌LA85（1.0×108 CFU/g），微康益生菌（苏州）股份有限公司;绵羊红细胞（SRBC）、小鼠淋巴瘤（YAC-1）细胞、豚鼠血清、鸡红细胞，Vitrocell公司;吉姆萨色素染料（Giemsa）、Hanks平衡鹽溶液、SA缓冲液，日本同仁化学研究所;细胞培养基1640，美国Hyclone公司;碘硝基氯化四氮唑蓝（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS），天津市津北精细化工有限公司。碳酸氢钠、丙酮、甲醇、乳酸钠、高铁氰化钾、氰化钾、NP40，均为分析纯;NAD（-20℃），国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器与设备
YP5002电子天平，上海佑科有限公司;721型分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司;分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司;CT14RD台式高速冷冻离心机，上海天美仪器有限公司;数显式游标卡尺0～200 mm，世达工具（上海）有限公司;恒温水浴锅，上海一科仪器有限公司;显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司;洁净工作台，力康生物医疗科技控股有限公司;全自动酶标仪，美国伯乐公司。
1.3方法
1.3.1动物分组及饲养方式160只雄性小鼠（ICR），平均体重为（20±2）g，随机分为4组，每组40只小鼠，分别命名为实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。实验1组进行测定小鼠体重、免疫器官指数以及迟发型变态反应（SRBC诱导小鼠DTH）;实验2组进行小鼠体液免疫功能实验（HC50的测定）;实验3组进行小鼠单核-吞噬细胞活性抑制实验（小鼠腹腔巨噬细胞能吞噬及红细胞实验）;实验4组进行NK细胞活性实验（LDH测定）。在规范的动物房中适应性饲养1周，每天给清洁级的颗粒鼠粮和水。在最后1天适应性喂养，根据各实验组小鼠的体重，将体重相近的10只小鼠分为1组，40只小鼠共分为4组，即对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，开展相关实验。
1.3.2嗜酸乳杆菌LA85剂量选择及给药方式将嗜酸乳杆菌LA85粉末与去离子水混合，通过磁力搅拌器搅拌，配制成5、10、20 mg/mL的嗜酸乳杆菌溶液，现配现用。每组小鼠于每天上午11：00进行1次灌胃，共灌胃30 d。对照组：灌胃去离子水1 mL。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃浓度为5、10、20 mg/mL的嗜酸乳杆菌溶液各1 mL。
1.3.3小鼠体重及免疫器官指数的测定实验期间，每天称取小鼠体重，并记录其体重变化。在灌胃实验完全结束后，采用断颈方式处死小鼠，并对其进行解剖。取出胸腺和脾脏，并迅速对脏器周围的结缔组织和血液进行清除，并称重。免疫器官指数（IOI）按照式（1）进行计算：
IOI（mg/g）=胸腺或脾脏鲜重量（mg）体重（g）（1）
1.3.4小鼠淋巴细胞增殖活性的测定（1）SRBC细胞悬浮液配制：新鲜绵羊血放入无菌锥形瓶中，通过定向摇动，去除绵羊血纤维。之后放入冰箱冷藏（4℃）备用。使用前用生理盐水离心（2 000 r/min、10 min）洗涤3次，分别配置成浓度为2%、10%的SRBC细胞悬液。（2）致敏：用2%SRBC静脉免疫，每只小鼠注射0.2 mL。（3）DTH的产生与测定：小鼠经过免疫后的4 d，采用游标卡尺对其左后足跖部进行测量。之后，对其测量部位进行静脉免疫，SRBC浓度为20%，注射剂量为20 μL。于24 h后，对其厚度和宽度进行测量[15]。以小鼠足跖的肿胀程度表示淋巴细胞增殖的情况。根据式（2）计算小鼠的足跖肿胀度： 足跖肿胀度（mm2）=足跖宽度×足跖厚度（2）
1.3.5小鼠血清中溶血素含量的测定（1）SRBC细胞悬浮液制备：按照1.3.4（1）制备。（2）制备补体和都氏试劑：取新鲜豚鼠血清5 mL，加入1 mL SRBC，于4 ℃放置30 min。之后，离心取上清液于-70℃保存备用。使用前采用8倍的SA液稀释。都氏试剂采用碳酸氢钠、高铁氰化钾和氰化钾配置。（3）免疫小鼠及分离血清：采用腹腔注射0.2 mL SRBC细胞悬浮液对小鼠进行免疫处理。免疫处理后4～5 d，铜鼓摘除眼球的方式取血，离心（6 000 r/min，4min）分离血清。（4）溶血反应：小鼠血清用200倍SA缓冲液稀释后备用。在11 mL血清中依次加入0.5 mL 10%SRBC和1 mL补体。同时以SA缓冲液为对照管。于水浴锅（37℃）中反应15 min后，冰浴终止反应。离心（2 000 r/min，10 min）取上清液1 mL，与3 mL都氏试剂混匀，静置10 min后，540 nm下测定吸光值。空白采用0.25 mL 10% SRBC和3.75 mL都氏试剂。半数溶血值（HC50）按照式（3）计算：
HC50=样品光密度值SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数（3）
1.3.6小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡红细胞能力的测定（1）鸡红细胞悬液制备：按照1.3.4（1）方法制备。（2）吞噬功能测定：小鼠腹腔吞噬细胞吞噬能力的检测按照金鑫等[14]建立的方法。其中SRBC浓度为20%，固定液为丙酮/甲醇溶液（1：1，v/v），染色液为4%的Giemsa-磷酸缓冲液，染色时间为3 min。染色结束后，无菌水漂洗晾干后镜检。吞噬百分率和吞噬指数按照式（4）计算：
吞噬百分率（%）=吞噬鸡红胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞×100;
吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数（4）
1.3.7小鼠NK细胞活性的测定（1）效应细胞的制备：在无菌环境中取出小鼠脾脏，至于Hanks液中，用镊子对其进行破碎，制备单细胞悬液。单细胞悬液经过过滤、洗涤、离心（1 000 r/min，10 min）后，获得细胞浆。通过加入无菌水使得细胞裂解，继而加入Hanks液。离心后用含有牛血清（10%）的培养基配置细胞悬液，细胞浓度为2×107个/mL。（2）靶细胞的制备：实验前1天对靶细胞进行传代培养。用前采用Hanks液对其洗涤3次，之后用1640培养基稀释，细胞浓度调整为4×105个/mL。（3）NK细胞活性检测：NK细胞活性检测参照赵宏宇等[16]建立的方法。其中细胞培养时间为4 h，细胞培养液与LDH基质液反应时间为5 min，检测波长为490 nm。NK细胞活性（%）按照式（5）计算：
NK细胞活性（%）=反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100%（5）
1.4数据分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差（±s），样本之间的平均值比较均采用t检验（P<0.05表示有显著性差异），采用Excel 2020和SPSS 22处理实验数据。
2结果和分析
2.1嗜酸乳杆菌LA85对小鼠体重的影响
如表1所示，实验1组为测量免疫器官指数和迟发型变态反应免疫实验的小鼠;实验2组为体液免疫实验的小鼠;实验3组为单核-吞噬细胞活性实验的小鼠;实验4组为NK细胞活性实验小鼠。结果显示，于对照组相比较，各剂量组对小鼠体重增长率无显著性（P>0.05）影响。这一结果说明，摄食嗜酸乳杆菌LA85不会影响小鼠体重，可以初步判定LA85为低毒性。
2.2嗜酸乳杆菌LA85对小鼠免疫器官指数的影响
胸腺和脾脏指数通常作为衡量机体免疫系统功能的重要指标[17]。通常情况下，机体免疫功能增强，会伴随胸腺和脾脏质量的增加。因此，免疫器官指数常被用于判断机体免疫功能的手段之一。如表2所示，与对照组比较，各剂量组中小鼠的胸腺指数均有明显增加（P<0.05）。低、中、高剂量组小鼠的脾脏指数分别增加了6.71%、8.74%、13.62%，其中高剂量组与对照组之间存在显著性差异（P<0.05）。各剂量组小鼠灌胃嗜酸乳杆菌LA85溶液30 d后，小鼠免疫器官指数均呈现升高趋势，表明嗜酸乳杆菌LA85可以增强小鼠的免疫功能。
2.3嗜酸乳杆菌LA85对小鼠淋巴细胞增殖的影响
淋巴细胞中含有T淋巴细胞和B淋巴细胞，它们是免疫系统机构和功能的核心，既负责介导机体的细胞免疫应答，又能够调节机体其他免疫细胞的功能[18]，是机体细胞免疫的直接反馈[19]。在免疫应答过程中，T淋巴细胞的激活、分化和增殖具有重要的作用。淋巴细胞增殖实验是检测T细胞免疫功能的方法，因此其增殖率可直接反映细胞免疫系统的功能状态。SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏性淋巴细胞，因此实验中常采用SRBC反复刺激足跖，观察其炎性肿胀程度，从而反映小鼠淋巴细胞的增殖情况。如图1所示，与对照组比较，实验组小鼠的足跖肿胀明显，且有显著差异（P<0.05），足跖肿胀度分别增加了131.75%、198.46%、257.70%。结果表明，嗜酸乳杆菌可以促进脾淋巴细胞增殖，提高小鼠淋巴细胞转化能力，具有体内免疫活性。
2.4嗜酸乳杆菌LA85对小鼠血清溶血素的影响
B细胞在进行体液免疫代谢过程中通常起着重要作用，其可以通过对抗体的识别和抗原的分泌，从而实现体液免疫[20]。因此，通过对血清出抗体分泌量的检测，从而反应机体的体液免疫能力[16]。如图2所示，与对照组比较，各剂量组中小鼠半数溶血值均有不同程度的增加，增长比例分别是12.69%、15.99%、21.48%，均存在显著性差异（P<0.05）。结果表明，嗜酸乳杆菌LA85可以促进小鼠体内溶血素值的增加，即提高小鼠的体液免疫。 2.5嗜酸乳杆菌LA85对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
巨噬细胞是机体发挥非特异性免疫反应的主要免疫细胞，参与机体免疫系统的第一道防线，因此，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要标志之一[20]。巨噬细胞是维持机体内环境稳定的一个重要系统[21]。如表3所示，与对照组比较，各剂量组中小鼠巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数得到显著（P<0.05）提升。其中，中剂量组和高剂量组吞噬百分率相近。而吞噬指数则呈现剂量效应关系，即随着剂量的增加，吞噬指数呈现显著增加的趋势。结果表明，一定剂量的嗜酸乳杆菌LA85一定程度上可以提升小鼠的吞噬能力。
2.6嗜酸乳杆菌LA85对小鼠NK细胞活性的影响
NK细胞是淋巴细胞细胞毒性的主要代表细胞群，在抗肿瘤和抗病毒免疫过程中起重要的作用[19]。NK细胞（自然杀伤细胞）能够直接杀伤靶细胞，而不依赖抗体和补体，从而直接实现免疫抑制功能。活化的NK细胞可直接分泌和合成多种细胞免疫因子，具有直接调节免疫的重要作用。因此，NK细胞活性通常被作为衡量机体免疫能力的重要指标之一。如图3所示，与对照组相比，各剂量组中小鼠的NK细胞活性均得到显著提高（P<0.05），其NK细胞活性分别增长25.50%、36.11%、41.26%。结果表明，嗜酸乳杆菌LA85能夠通过提高健康小鼠的NK细胞活性从而增强机体免疫力。
3结论
益生乳酸杆菌在宿主体内通过对营养物质的消化和吸收，传递信号给免疫细胞，对宿主免疫反应进行调节[22-23]。有研究表明，益生乳酸菌可通过刺激肠道局部产生免疫抑制反应，提高机体免疫抗体水平或巨噬细胞的活性，从而有效增强机体的免疫抑制功能。但具体调节机制尚不清楚，并且这种调节作用可能与菌种相关，具有一定的菌株特异性[24]。本文的研究结果验证了嗜酸乳杆菌LA85具有细菌低毒性，能够作用于小鼠免疫器官，可能通过增强小鼠细胞免疫、体液免疫，改善小鼠巨噬细胞以及NK细胞活性等途径从而增强小鼠机体免疫机能，但是具体的免疫作用机制有待进一步研究。本文的研究可为嗜酸乳杆菌LA85改善机体免疫作用提供理论依据。◇
参考文献
[1]Suda Y，Villena J，Yu T，et al.Immunobiotic Lactobacillus jenseniias immune-health promoting factor to improve growth performance and productivity in post-weaning pigs[J]. BMC Immunology，2014，15（1）：1-18.
[2]Alberto F，et al.Lactobacillus amylovorus inhibits the TLR4 inflammatory signaling triggered by enterotoxigenic Escherichia coli via m odulation of the negative regulators and involvement of TLR2 in intestinal Caco-2 cells and pig explants[J]. PLoS One，2014，9（4）：e94891.
[3]Adeniyi B A，Adietoye A，Ayeni F A.Antibacterial activities of lactic acid bacteria isolated from cow faeces against potential enteric pathogens[J].African Health Sciences，2015，15（3）：888-895.
[4]Koenen M，Kramer J，Hulst R，et al.Immunomodulation by probiotic lactobacilli in layer and meat-type chickens[J]. British Poultry Science，2004，45（3）：355-366.
[5]Yisa T A，et al.Effect of probiotics （Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum）as immune stimulant on hybrid catfish Heteroclarias[J]. British Microbiology Research Journal，2015，9（1）：1-6.
[6]张秋月，王刚，陈坤朋，等.嗜酸乳杆菌在初始弱酸碱条件下对HT-29细胞免疫因子的调节作用[J].食品科学，2020，41（19）：191-197.
[7]Setyawardani T，et al.Antimicrobial activity and adhesion ability of indigenous lactic acid bacteria isolated from goat milk[J]. International Food Research Journal，2014，21（3）：959-964.
[8]Tomosada Y，et al.Immunoregulatory effect of Bifidobacteria strains in porcine intestinal epithelial cells through modulation of ubiquitin-editing enzyme A20 expression[J]. PLoS One，2013，8（3）：e59259. [9]斯日古楞，張润平，周瑞峰.乳酸菌的生理功能及其作用机理[J]. 饲料与畜牧，2012（6）：49-51.
[10]文国樑，于明超，李卓佳，等.中草药饲料添加剂在水产养殖中的应用研究[J].广东农业科学，2011，38（24）：114-119.
[11]谢文惠.复合益生菌制剂对肉鸡生长、免疫功能及肠道菌群的影响[D].黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2018.
[12]徐佳，夏伯候，邓静，等.妇科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的研究[J].湖南中医药大学学报，2020，40（11）：1320-1326.
[13]杜联峰，田忠，夏嫱，等.西红花苷促进小鼠脾淋巴细胞增殖[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32（6）：793-796.
[14]金鑫，张艺钟，薛玉环，等.绞股蓝水煎剂对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响[J].中兽医医药杂志，2018，37（1）：38-40.
[15]杭兴伟，增田泰伸，木村守，等.硫酸氨基葡萄糖对口服透明质酸缓解小鼠佐剂性关节炎的增效作用[J].食品科学，2015，36（5）：189-194.
[16]赵宏宇，崔林虎，张伟云.蛹虫草对小鼠体液免疫功能和NK细胞活性的影响[J].园艺与种苗，2020，40（2）：3-5、49.
[17]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2011.
[18]常桂芳.乳酸菌黏附派伊尔结及免疫调节作用研究[D].江苏无锡：江南大学，2009.
[19]Fan P，Han B，Hu H，et al.Proteome of thymus and spleen reveals that 10-hydroxydec-2-enoic acid could enhance immunity in mice[J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets，2020，24（3）：267-279.
[20]柏伟荣，杨绪芳，张海弢，等.西洋参与淫羊藿配伍增强免疫力和缓解体力疲劳功能实验研究[J].食品与发酵科技：2020（2）：5-9.
[21]Gil D，et al.Modulation of macrophage apoptosis by antimycobacterial therapy：physiological role of apoptosis in the control of Mycobacterium thberculosis [J].Toxicology & Applied Pharmacology，2003，190（2）：111-119.
[22]Kalam A，Manobendro S，Li T，et al.Probiotic species in the modulation of gut microbiota：an overview[J]. Biomed Research International，2018（2018）：9478630.
[23]张丽.传统发酵牦牛奶中益生乳杆菌筛选及其免疫调节功能研究[D].兰州：甘肃农业大学，2014.
[24]蒙月月，Sathi Chowdhury，霍贵成，等.植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠免疫调节作用初步研究[J].食品工业科技，2018，39（7）：303-308.
Research on The Effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on Immune Function of Mice
ZHAO Lin，FAN Ya-chen，HUANG Zi-zheng，XUE Feng，ZHANG Sen
（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）
Abstract：Objective To study the effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on immune function of mice.Method The mice were treated with Lactobacillus acidophilus LA85 by oral administration.Totally 160 mice were divided into low，media，high dose groups.The effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on immune function was evaluated by analyzing the mouse body weight index，spleen index，thymus index，cellular immunity，humoral immunity，monocyte-phagocytic cell activity and NK cell activity.Result Compared with control，thymus index increased significantly in all groups.The increase in spleen index was only observed in high dose group.The lymphocyte proliferation，HC50，phagocytosis of macrophages，NK cell activity of all the low，media，high groups were promoted significantly.Lactobacillus acidophilus LA85 had no effect on the body weight index of mice.Conclusion Treating with Lactobacillus acidophilus LA85 by oral administration can enhance cellular immunity，humoral immunity and NK cell activity of mice.
Keywords：Lactobacillus acidophilus LA85;immune function;mice
作者简介：赵琳（1999—），女，在读硕士研究生，研究方向：生物发酵与转化。
通信作者：张森（1988—），男，副教授，研究方向：工业微生物。
摘要：目的：研究嗜酸乳杆菌LA85对小鼠免疫机能的影响。方法：将160只雄性小鼠随机分为4组，即对照组、低、中、高三个剂量组。采用灌胃的方式给予实验小鼠不同剂量的嗜酸乳杆菌LA85。通过对小鼠平均体重、脾脏和胸腺免疫指数、细胞免疫、体液免疫、单核-吞噬性细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）活性的评价，探讨嗜酸乳杆菌LA85对小鼠免疫机能的影响机制。结果：与对照组相比，嗜酸乳杆菌LA85低、中、高剂量组能够显著提升小鼠的胸腺指数，嗜酸乳杆菌LA85高剂量组能够显著提升小鼠的脾脏指数。同时能够显著提高小鼠的淋巴细胞增殖分化能力、半数溶血值、巨噬细胞的吞噬能力、NK细胞的细胞活性;嗜酸乳杆菌对小鼠的体重没有影响。结论：给予小鼠口服嗜酸乳杆菌LA85可以通过改善细胞免疫和体液免疫功能，从而提高免疫力。
关键词：嗜酸乳杆菌LA85;免疫机能;小鼠
益生菌是当宿主摄入一定量时，能够通过调节肠道菌群的平衡来维持宿主消化系统和肠道健康的一类微生物[1-2]。乳酸菌作为一种益生菌，对人类的一些疾病，如炎症性肠疾病、肠功能障碍和结肠癌等起到预防和治疗的效果，同时对人体免疫功能也有一定的增强作用[3-6]。乳酸菌细胞通过对食道肠黏膜上皮巨噬细胞和其他宿主黏膜的免疫黏附作用进入人体肠道，刺激机体的免疫系统，通过免疫调节趋化因子和巨噬细胞因子的产生，达到不断增强机体宿主黏膜免疫能力的重要作用[7-8]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属于革兰氏阳性菌，其在机体内可以释放乙酸和乳酸等物质，从而起到抑制有害微生物生长的作用，继而发挥调节肠道菌群平衡的功能[9-10]。谢文惠[11]研究表明，含嗜酸乳杆菌的复合益生菌制剂在一定程度上提高了肉鸡血清中免疫球蛋白含量，从而增强肉鸡机体免疫性能。本实验使用嗜酸乳杆菌LA85饲喂健康小鼠，以小鼠体重、免疫器官指数，以及细胞免疫和体液免疫等相关参数为评价指标[12-14]，探讨嗜酸乳杆菌对小鼠免疫能力的影响，为进一步研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料、试剂及实验动物
SPF级，ICR小鼠，雄性，8 w龄，初始体重18～22 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司;清洁级颗粒鼠粮和清洁级垫料，购自江苏协同医药生物工程有限公司。
嗜酸乳杆菌LA85（1.0×108 CFU/g），微康益生菌（苏州）股份有限公司;绵羊红细胞（SRBC）、小鼠淋巴瘤（YAC-1）细胞、豚鼠血清、鸡红细胞，Vitrocell公司;吉姆萨色素染料（Giemsa）、Hanks平衡鹽溶液、SA缓冲液，日本同仁化学研究所;细胞培养基1640，美国Hyclone公司;碘硝基氯化四氮唑蓝（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS），天津市津北精细化工有限公司。碳酸氢钠、丙酮、甲醇、乳酸钠、高铁氰化钾、氰化钾、NP40，均为分析纯;NAD（-20℃），国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器与设备
YP5002电子天平，上海佑科有限公司;721型分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司;分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司;CT14RD台式高速冷冻离心机，上海天美仪器有限公司;数显式游标卡尺0～200 mm，世达工具（上海）有限公司;恒温水浴锅，上海一科仪器有限公司;显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司;洁净工作台，力康生物医疗科技控股有限公司;全自动酶标仪，美国伯乐公司。
1.3方法
1.3.1动物分组及饲养方式160只雄性小鼠（ICR），平均体重为（20±2）g，随机分为4组，每组40只小鼠，分别命名为实验1组、实验2组、实验3组、实验4组。实验1组进行测定小鼠体重、免疫器官指数以及迟发型变态反应（SRBC诱导小鼠DTH）;实验2组进行小鼠体液免疫功能实验（HC50的测定）;实验3组进行小鼠单核-吞噬细胞活性抑制实验（小鼠腹腔巨噬细胞能吞噬及红细胞实验）;实验4组进行NK细胞活性实验（LDH测定）。在规范的动物房中适应性饲养1周，每天给清洁级的颗粒鼠粮和水。在最后1天适应性喂养，根据各实验组小鼠的体重，将体重相近的10只小鼠分为1组，40只小鼠共分为4组，即对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，开展相关实验。
1.3.2嗜酸乳杆菌LA85剂量选择及给药方式将嗜酸乳杆菌LA85粉末与去离子水混合，通过磁力搅拌器搅拌，配制成5、10、20 mg/mL的嗜酸乳杆菌溶液，现配现用。每组小鼠于每天上午11：00进行1次灌胃，共灌胃30 d。对照组：灌胃去离子水1 mL。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃浓度为5、10、20 mg/mL的嗜酸乳杆菌溶液各1 mL。
1.3.3小鼠体重及免疫器官指数的测定实验期间，每天称取小鼠体重，并记录其体重变化。在灌胃实验完全结束后，采用断颈方式处死小鼠，并对其进行解剖。取出胸腺和脾脏，并迅速对脏器周围的结缔组织和血液进行清除，并称重。免疫器官指数（IOI）按照式（1）进行计算：
IOI（mg/g）=胸腺或脾脏鲜重量（mg）体重（g）（1）
1.3.4小鼠淋巴细胞增殖活性的测定（1）SRBC细胞悬浮液配制：新鲜绵羊血放入无菌锥形瓶中，通过定向摇动，去除绵羊血纤维。之后放入冰箱冷藏（4℃）备用。使用前用生理盐水离心（2 000 r/min、10 min）洗涤3次，分别配置成浓度为2%、10%的SRBC细胞悬液。（2）致敏：用2%SRBC静脉免疫，每只小鼠注射0.2 mL。（3）DTH的产生与测定：小鼠经过免疫后的4 d，采用游标卡尺对其左后足跖部进行测量。之后，对其测量部位进行静脉免疫，SRBC浓度为20%，注射剂量为20 μL。于24 h后，对其厚度和宽度进行测量[15]。以小鼠足跖的肿胀程度表示淋巴细胞增殖的情况。根据式（2）计算小鼠的足跖肿胀度： 足跖肿胀度（mm2）=足跖宽度×足跖厚度（2）
1.3.5小鼠血清中溶血素含量的测定（1）SRBC细胞悬浮液制备：按照1.3.4（1）制备。（2）制备补体和都氏试劑：取新鲜豚鼠血清5 mL，加入1 mL SRBC，于4 ℃放置30 min。之后，离心取上清液于-70℃保存备用。使用前采用8倍的SA液稀释。都氏试剂采用碳酸氢钠、高铁氰化钾和氰化钾配置。（3）免疫小鼠及分离血清：采用腹腔注射0.2 mL SRBC细胞悬浮液对小鼠进行免疫处理。免疫处理后4～5 d，铜鼓摘除眼球的方式取血，离心（6 000 r/min，4min）分离血清。（4）溶血反应：小鼠血清用200倍SA缓冲液稀释后备用。在11 mL血清中依次加入0.5 mL 10%SRBC和1 mL补体。同时以SA缓冲液为对照管。于水浴锅（37℃）中反应15 min后，冰浴终止反应。离心（2 000 r/min，10 min）取上清液1 mL，与3 mL都氏试剂混匀，静置10 min后，540 nm下测定吸光值。空白采用0.25 mL 10% SRBC和3.75 mL都氏试剂。半数溶血值（HC50）按照式（3）计算：
HC50=样品光密度值SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数（3）
1.3.6小鼠腹腔吞噬细胞吞噬鸡红细胞能力的测定（1）鸡红细胞悬液制备：按照1.3.4（1）方法制备。（2）吞噬功能测定：小鼠腹腔吞噬细胞吞噬能力的检测按照金鑫等[14]建立的方法。其中SRBC浓度为20%，固定液为丙酮/甲醇溶液（1：1，v/v），染色液为4%的Giemsa-磷酸缓冲液，染色时间为3 min。染色结束后，无菌水漂洗晾干后镜检。吞噬百分率和吞噬指数按照式（4）计算：
吞噬百分率（%）=吞噬鸡红胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞×100;
吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数（4）
1.3.7小鼠NK细胞活性的测定（1）效应细胞的制备：在无菌环境中取出小鼠脾脏，至于Hanks液中，用镊子对其进行破碎，制备单细胞悬液。单细胞悬液经过过滤、洗涤、离心（1 000 r/min，10 min）后，获得细胞浆。通过加入无菌水使得细胞裂解，继而加入Hanks液。离心后用含有牛血清（10%）的培养基配置细胞悬液，细胞浓度为2×107个/mL。（2）靶细胞的制备：实验前1天对靶细胞进行传代培养。用前采用Hanks液对其洗涤3次，之后用1640培养基稀释，细胞浓度调整为4×105个/mL。（3）NK细胞活性检测：NK细胞活性检测参照赵宏宇等[16]建立的方法。其中细胞培养时间为4 h，细胞培养液与LDH基质液反应时间为5 min，检测波长为490 nm。NK细胞活性（%）按照式（5）计算：
NK细胞活性（%）=反应孔OD-自然释放孔OD最大释放孔OD-自然释放孔OD×100%（5）
1.4数据分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差（±s），样本之间的平均值比较均采用t检验（P<0.05表示有显著性差异），采用Excel 2020和SPSS 22处理实验数据。
2结果和分析
2.1嗜酸乳杆菌LA85对小鼠体重的影响
如表1所示，实验1组为测量免疫器官指数和迟发型变态反应免疫实验的小鼠;实验2组为体液免疫实验的小鼠;实验3组为单核-吞噬细胞活性实验的小鼠;实验4组为NK细胞活性实验小鼠。结果显示，于对照组相比较，各剂量组对小鼠体重增长率无显著性（P>0.05）影响。这一结果说明，摄食嗜酸乳杆菌LA85不会影响小鼠体重，可以初步判定LA85为低毒性。
2.2嗜酸乳杆菌LA85对小鼠免疫器官指数的影响
胸腺和脾脏指数通常作为衡量机体免疫系统功能的重要指标[17]。通常情况下，机体免疫功能增强，会伴随胸腺和脾脏质量的增加。因此，免疫器官指数常被用于判断机体免疫功能的手段之一。如表2所示，与对照组比较，各剂量组中小鼠的胸腺指数均有明显增加（P<0.05）。低、中、高剂量组小鼠的脾脏指数分别增加了6.71%、8.74%、13.62%，其中高剂量组与对照组之间存在显著性差异（P<0.05）。各剂量组小鼠灌胃嗜酸乳杆菌LA85溶液30 d后，小鼠免疫器官指数均呈现升高趋势，表明嗜酸乳杆菌LA85可以增强小鼠的免疫功能。
2.3嗜酸乳杆菌LA85对小鼠淋巴细胞增殖的影响
淋巴细胞中含有T淋巴细胞和B淋巴细胞，它们是免疫系统机构和功能的核心，既负责介导机体的细胞免疫应答，又能够调节机体其他免疫细胞的功能[18]，是机体细胞免疫的直接反馈[19]。在免疫应答过程中，T淋巴细胞的激活、分化和增殖具有重要的作用。淋巴细胞增殖实验是检测T细胞免疫功能的方法，因此其增殖率可直接反映细胞免疫系统的功能状态。SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏性淋巴细胞，因此实验中常采用SRBC反复刺激足跖，观察其炎性肿胀程度，从而反映小鼠淋巴细胞的增殖情况。如图1所示，与对照组比较，实验组小鼠的足跖肿胀明显，且有显著差异（P<0.05），足跖肿胀度分别增加了131.75%、198.46%、257.70%。结果表明，嗜酸乳杆菌可以促进脾淋巴细胞增殖，提高小鼠淋巴细胞转化能力，具有体内免疫活性。
2.4嗜酸乳杆菌LA85对小鼠血清溶血素的影响
B细胞在进行体液免疫代谢过程中通常起着重要作用，其可以通过对抗体的识别和抗原的分泌，从而实现体液免疫[20]。因此，通过对血清出抗体分泌量的检测，从而反应机体的体液免疫能力[16]。如图2所示，与对照组比较，各剂量组中小鼠半数溶血值均有不同程度的增加，增长比例分别是12.69%、15.99%、21.48%，均存在显著性差异（P<0.05）。结果表明，嗜酸乳杆菌LA85可以促进小鼠体内溶血素值的增加，即提高小鼠的体液免疫。 2.5嗜酸乳杆菌LA85对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
巨噬细胞是机体发挥非特异性免疫反应的主要免疫细胞，参与机体免疫系统的第一道防线，因此，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要标志之一[20]。巨噬细胞是维持机体内环境稳定的一个重要系统[21]。如表3所示，与对照组比较，各剂量组中小鼠巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数得到显著（P<0.05）提升。其中，中剂量组和高剂量组吞噬百分率相近。而吞噬指数则呈现剂量效应关系，即随着剂量的增加，吞噬指数呈现显著增加的趋势。结果表明，一定剂量的嗜酸乳杆菌LA85一定程度上可以提升小鼠的吞噬能力。
2.6嗜酸乳杆菌LA85对小鼠NK细胞活性的影响
NK细胞是淋巴细胞细胞毒性的主要代表细胞群，在抗肿瘤和抗病毒免疫过程中起重要的作用[19]。NK细胞（自然杀伤细胞）能够直接杀伤靶细胞，而不依赖抗体和补体，从而直接实现免疫抑制功能。活化的NK细胞可直接分泌和合成多种细胞免疫因子，具有直接调节免疫的重要作用。因此，NK细胞活性通常被作为衡量机体免疫能力的重要指标之一。如图3所示，与对照组相比，各剂量组中小鼠的NK细胞活性均得到显著提高（P<0.05），其NK细胞活性分别增长25.50%、36.11%、41.26%。结果表明，嗜酸乳杆菌LA85能夠通过提高健康小鼠的NK细胞活性从而增强机体免疫力。
3结论
益生乳酸杆菌在宿主体内通过对营养物质的消化和吸收，传递信号给免疫细胞，对宿主免疫反应进行调节[22-23]。有研究表明，益生乳酸菌可通过刺激肠道局部产生免疫抑制反应，提高机体免疫抗体水平或巨噬细胞的活性，从而有效增强机体的免疫抑制功能。但具体调节机制尚不清楚，并且这种调节作用可能与菌种相关，具有一定的菌株特异性[24]。本文的研究结果验证了嗜酸乳杆菌LA85具有细菌低毒性，能够作用于小鼠免疫器官，可能通过增强小鼠细胞免疫、体液免疫，改善小鼠巨噬细胞以及NK细胞活性等途径从而增强小鼠机体免疫机能，但是具体的免疫作用机制有待进一步研究。本文的研究可为嗜酸乳杆菌LA85改善机体免疫作用提供理论依据。◇
参考文献
[1]Suda Y，Villena J，Yu T，et al.Immunobiotic Lactobacillus jenseniias immune-health promoting factor to improve growth performance and productivity in post-weaning pigs[J]. BMC Immunology，2014，15（1）：1-18.
[2]Alberto F，et al.Lactobacillus amylovorus inhibits the TLR4 inflammatory signaling triggered by enterotoxigenic Escherichia coli via m odulation of the negative regulators and involvement of TLR2 in intestinal Caco-2 cells and pig explants[J]. PLoS One，2014，9（4）：e94891.
[3]Adeniyi B A，Adietoye A，Ayeni F A.Antibacterial activities of lactic acid bacteria isolated from cow faeces against potential enteric pathogens[J].African Health Sciences，2015，15（3）：888-895.
[4]Koenen M，Kramer J，Hulst R，et al.Immunomodulation by probiotic lactobacilli in layer and meat-type chickens[J]. British Poultry Science，2004，45（3）：355-366.
[5]Yisa T A，et al.Effect of probiotics （Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum）as immune stimulant on hybrid catfish Heteroclarias[J]. British Microbiology Research Journal，2015，9（1）：1-6.
[6]张秋月，王刚，陈坤朋，等.嗜酸乳杆菌在初始弱酸碱条件下对HT-29细胞免疫因子的调节作用[J].食品科学，2020，41（19）：191-197.
[7]Setyawardani T，et al.Antimicrobial activity and adhesion ability of indigenous lactic acid bacteria isolated from goat milk[J]. International Food Research Journal，2014，21（3）：959-964.
[8]Tomosada Y，et al.Immunoregulatory effect of Bifidobacteria strains in porcine intestinal epithelial cells through modulation of ubiquitin-editing enzyme A20 expression[J]. PLoS One，2013，8（3）：e59259. [9]斯日古楞，張润平，周瑞峰.乳酸菌的生理功能及其作用机理[J]. 饲料与畜牧，2012（6）：49-51.
[10]文国樑，于明超，李卓佳，等.中草药饲料添加剂在水产养殖中的应用研究[J].广东农业科学，2011，38（24）：114-119.
[11]谢文惠.复合益生菌制剂对肉鸡生长、免疫功能及肠道菌群的影响[D].黑龙江大庆：黑龙江八一农垦大学，2018.
[12]徐佳，夏伯候，邓静，等.妇科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的研究[J].湖南中医药大学学报，2020，40（11）：1320-1326.
[13]杜联峰，田忠，夏嫱，等.西红花苷促进小鼠脾淋巴细胞增殖[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32（6）：793-796.
[14]金鑫，张艺钟，薛玉环，等.绞股蓝水煎剂对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响[J].中兽医医药杂志，2018，37（1）：38-40.
[15]杭兴伟，增田泰伸，木村守，等.硫酸氨基葡萄糖对口服透明质酸缓解小鼠佐剂性关节炎的增效作用[J].食品科学，2015，36（5）：189-194.
[16]赵宏宇，崔林虎，张伟云.蛹虫草对小鼠体液免疫功能和NK细胞活性的影响[J].园艺与种苗，2020，40（2）：3-5、49.
[17]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，2011.
[18]常桂芳.乳酸菌黏附派伊尔结及免疫调节作用研究[D].江苏无锡：江南大学，2009.
[19]Fan P，Han B，Hu H，et al.Proteome of thymus and spleen reveals that 10-hydroxydec-2-enoic acid could enhance immunity in mice[J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets，2020，24（3）：267-279.
[20]柏伟荣，杨绪芳，张海弢，等.西洋参与淫羊藿配伍增强免疫力和缓解体力疲劳功能实验研究[J].食品与发酵科技：2020（2）：5-9.
[21]Gil D，et al.Modulation of macrophage apoptosis by antimycobacterial therapy：physiological role of apoptosis in the control of Mycobacterium thberculosis [J].Toxicology & Applied Pharmacology，2003，190（2）：111-119.
[22]Kalam A，Manobendro S，Li T，et al.Probiotic species in the modulation of gut microbiota：an overview[J]. Biomed Research International，2018（2018）：9478630.
[23]张丽.传统发酵牦牛奶中益生乳杆菌筛选及其免疫调节功能研究[D].兰州：甘肃农业大学，2014.
[24]蒙月月，Sathi Chowdhury，霍贵成，等.植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠免疫调节作用初步研究[J].食品工业科技，2018，39（7）：303-308.
Research on The Effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on Immune Function of Mice
ZHAO Lin，FAN Ya-chen，HUANG Zi-zheng，XUE Feng，ZHANG Sen
（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）
Abstract：Objective To study the effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on immune function of mice.Method The mice were treated with Lactobacillus acidophilus LA85 by oral administration.Totally 160 mice were divided into low，media，high dose groups.The effect of Lactobacillus acidophilus LA85 on immune function was evaluated by analyzing the mouse body weight index，spleen index，thymus index，cellular immunity，humoral immunity，monocyte-phagocytic cell activity and NK cell activity.Result Compared with control，thymus index increased significantly in all groups.The increase in spleen index was only observed in high dose group.The lymphocyte proliferation，HC50，phagocytosis of macrophages，NK cell activity of all the low，media，high groups were promoted significantly.Lactobacillus acidophilus LA85 had no effect on the body weight index of mice.Conclusion Treating with Lactobacillus acidophilus LA85 by oral administration can enhance cellular immunity，humoral immunity and NK cell activity of mice.
Keywords：Lactobacillus acidophilus LA85;immune function;mice