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摘要：目的：探讨FTOrs9939609突变基因型TA/AA对超重与肥胖大学生的形态和糖代谢相关指标的影响。方法：为150名自愿参与的上海某高校大一学生测量其形态以及体脂等指标，分析血糖和胰岛素水平，估算胰岛素抵抗水平。结果：超重与肥胖大学生rs9939609多态性等位基因频率与一般人群基本一致，FTOrs9939609TA/AA基因型对超重与肥胖青少年的形态与身体成分具有影响，FTOrs9939609位点的A等位基因更易于发生胰岛素抵抗。
关键词：FTOSNPsrs9939609；TA/AA基因型；胰岛素抵抗；超重与肥胖；男大学生；身体形态
中图分类号：G804 文献标识码：A
文章编号：1008-2808（2015）06-0020-04
FTO基因是唯一被广泛验证的肥胖相关基因，它与人体的体脂、BMI、腰围、臀围以及血清瘦素水平等关联性最强。人类和动物研究均证实，完整的FTO基因功能对正常生理机能十分重要。2007年，Frayling与Scuteri A等证明了在FTO基因第1内含子区域的SNPs rs9939609与BMI存在显著相关。Frayling等人报道在英国FTO基因突变与儿童和成人肥胖有高度相关性，GWAS对38759名受试者的研究发现，位于FTO基因rs9939609位点单核苷酸发生的突变（该位点为单核苷酸T→A的突变）与T2MD高度相关。因此，探讨FTOrs9939609突变基因型TA/AA对超重与肥胖大学生的形态、机能和糖代谢相关指标的影响具有十分重要的临床意义。本文通过对大样本进行随机抽样150名超重与肥胖大学进行评估，以揭示基因突变对表型的影响，为该年龄段超重与肥胖青少年控制体重提供理论根据。
1 实验对象与方法
1.1 实验对象
选取上海某高校大一学生2850名，男性，汉族，年龄18-19岁。清晨空腹，进行两次测量身高、体重，通过体质量指数（BMI）=体质量/身高2（kg/㎡）公式计算出BMI。在2850名中，符合BMI≥24kg/㎡有556名，经自愿报名最后实际纳入实验人数150名，所有参与者无内分泌以及临床相关疾病史。
1.2 测试内容与方法
1.2.1 形态学指标的测量参照国民体质测量要求进行。身高、体重为仪器为SK-CK超声波体检机。围度包括腰围（WC）、臀围（HC）、胸围（BC）、大腿围（UPLC）4个部位，用皮尺测量。皮褶厚度：皮肤及皮下脂肪厚度的测量值之和，应用皮褶卡钳测量，取四个部位。（1）肱三头肌部旁：于尺骨鹰嘴与肩峰连线中点处，与上肢纵轴平行捏起皮褶；（2）肩胛部位：于肩胛下角lcm处，与脊柱夹角45°角；（3）腹部：锁骨中线与脐线平面交界处，与人体纵轴平行提捏皮褶。（4）大腿内侧：腹股沟斜线中点与同侧髌骨中点连线的中点处，皮褶方向与下肢纵轴平行。同时，收集被试的医学出生证明书，了解出生时体重和身长。内脏脂肪指数（VFI）由欧姆龙V-Body测得。
1.2.2 血样采集及处理 禁食10-12h，空腹抽取肘部肘正中静脉或者贵要静脉血，4ml置于不含抗凝剂的真空管空腹血糖、胰岛素，2ml置EDTA-K2抗凝管，-80℃保存，用于FTO基因检测。
1.2.3 FTO基因SNPrs9939609以及定点突变检测 通过全血提取白细胞，利用QIAamp DNA Minikit（Qiagen，Hilden，Germany）试剂盒提取DNA。上游引物序列为rs9939609-F：CTGGCTCTT-GAATGAAATAGGA；下游引物序列为rs9939609-R：CAGCTATTTGCATTTCAGTTTG。该引物通过在线软件Primer3设计。PCR反应体系：10×扩增缓冲液（lOul）；4种dNTP混合物（各200umol/L）；引物（各10-lOOpmol）；模板DNA（0.1-2ug）；TaqDNA聚合酶（2.5u）；Mg2+（1.5mmol/L）；加双或三蒸水至lOOul。PCR产物经虾碱酶SAP（Pro-mega，Madison，USA）和外切酶I（Epicentre，Madi-son，WI，USA）纯化后用BigDye3.1试剂盒（Ap-plied Biosystems，Foster City，CA，USA）测序，测序仪为ABI3130XL，用Polyphred软件分析，结合人工校，给出实验结果。具体实验操作步骤参照公开发表文献。
1.3 统计分析
描述性统计分别运用方差分析（连续性变量）和卡方检验（分类变量）。干预前基因型基础指标比较，用T检验分析。统计分析由9.3版SAS软件（SAS Institute Inc.，Caiy，N.C，USA）分析完成，显著性差异设定为P<0.05，非常显著设定为P<0.001。
2 实验结果
2.1 FTO rs9939609位点分型
实验结果显示，150个被试的FTOrs9939609位点全部被成功分型，重复检测100%得到验证；rs9939609位点有TT、TA与AA三个基因型，A等位基因为T→A突变。从遗传学基础研究可知FTO基因TA和AA基因型是肥胖及其相关疾病风险易感基因型（TT：正常纯合子基因型，TA：突变杂合子，AA：突变纯合子）。分析结果显示，150人中117人为正常纯合子TT，32人突变杂合子TA，1人为突变纯合子AA，T等位基因频率为88.67%，A等位基因频率为11.33%，此结果与人类基因库中中国人种比率一致（如表1）。
2.2 FTOrs9939609TT基因型与TA/AA基因型肥胖及其体脂相关指标的比较
根据（表1）结果可知：AA纯合子在本人样本中人数较少，因此在以下各个分类研究中，将TA与AA两个基因型合并，视为突变基因组。分为TT组（117人），TA/AA组（33人）。结果显示（见表2），与TT比较：TA/AA组的体重、BMI、VFI非常显著高于TT组（P<0.001），BMI平均高出2kg/㎡，VFI平均约高出3个指数点，TA/AA组的BC、WC、HC、UPLC显著高于TT组（P<0.05）。腰围平均高出4.25cm。 2.3 rs9939609TT基因型与TA/AA基因型的血糖及胰岛素抵抗的比较
实验结果显示（见表3），与TT组比较：TA/AA组的FPG、FINS、HOMA-IR显著高于TT组（P<0.05）。
3 讨论
3.1 不同rs9939609基因型对肥胖及其体脂相关指标的影响
FTO SNPs在许多血统中都与肥胖相关性状相关。研究表明FTO rs9939609是最常见、被解释最多的变异的位点，对肥胖影响作用最大。本研究结果也同样呈现rs9939609SNP对肥胖性状的影响，表现为突变TA/AA组的体重、BMI非常显著高于TT组，这与复旦大学儿科医院曹凌峰课题组研究结果一致，rs9939609TA/AA基因型儿童青少年的BMI显著高于TT基因型（P=0.0003）。另外，本研究结果还显示TA/AA基因型携带者BMI比TT基因型携带者平均高出2kg/㎡，这与一项Meta关于亚洲血统的96，551例普通人群的调查资料结果基本一致，该调查结果显示每个额外最小等位基因可以增加患肥胖风险1.25倍，同时可使BMI增加0.26kg/㎡。
rs9939609SNP对体脂分布存在影响。杨锐睿博士研究显示中学生FTO基因rs9939609TA/AA基因型比TT基因型体脂百分比显著性增高。本研究结果TA/AA携带者的BC、WC、HC、UPLC显著高于TT基因型携带者，并且TA/AA携带者的VFI非常显著高于TT基因型携带者，但是，体脂分比、出生体重、出生身高、所有皮褶厚度的未见显著性影响，表明rs9939609SNPs对内脏脂肪以及身体围度产生了影响。可能是由于FTO蛋白调控修饰的结果。FTO蛋白可调控食欲，可调控mRNA的翻译以及身体生长。FTO蛋白与大肠杆菌AlkB酶有高度的同源性，可发挥去甲基化酶功能，该蛋白可能作为转录辅助因子参与脂肪细胞的生长和发育的调控。同时，FTO风险等位基因能影响胃饥饿素mRNA的甲基化，这可能影响循环中蛋白水平，胃饥饿素是一种由胃部产生的有力促进食欲的信号蛋白。胃饥饿素信号的变化可能是FTO与BMI增加相关性的效应物。FTO基因rs9939609多态性主要影响进食后的饱足感，往往食欲更旺盛，更易发生进食失控，且偏爱高热量食物，因而导致肥胖或超重，从而引起内脏脂肪含量增加。
本研究rs9939609多态性（rs9939609SNP）对出生体重的影响与Jess T，Horikoshi M以及Kilpel-ainen T O等研究一致，没有发现FTOSNPs影响出生体重。报道显示从儿童时期，FTO对身体组成和肥胖的影响才开始，并持续到成年时期，然而在出生时，FTO基因的变异和体重和庞代恩指数不相关，其作用还没有出现，到2.5周岁开始，FTO基因的变异开始和体重、庞代恩指数相关，但是这种相关性会随着年龄逐渐减弱。
3.2 不同rs9939609基因型对血糖及胰岛素抵抗的影响
FTO突变是肥胖症及2型糖尿病的主要诱因。本研究结果显示，与TT组比较，TA/AA组的血浆FBG和FINs水平以及HOMA-IR显著高于TT组（P<0.05）。表明FTO基因突变影响了糖代谢的进行。这与以往临床研究基本一致。FTO基因能编码一种将mRNA中的mA6逆转到常规腺苷的酶引起N6-甲基腺苷水平低下。FTO基因高表达于下丘脑，因此，影响调节能量代谢和食欲，导致肥胖代谢异常。Tschritter O等FTO基因变异在中枢可引起大脑皮质的胰岛素敏感性下降，表明中枢也出现胰岛素抵抗。而在人和动物研究中还发现FTO蛋白在骨骼肌高表达，其变异后骨骼肌中的磷酸肌酸（CK）和无机盐含量容易恢复，骨骼肌细胞线粒体氧化磷酸化水平较高，并且肝脏胰岛素抵抗增高，FPG较高。Susanne等发现rs9939609SNP与胰岛素抵抗有关，每一个风险等位基因可使FPG升高3.25mμ/L，表明FTOrs9939609可能通过中枢和外周机制影响超重与肥胖者的糖代谢调节。
因此，通过分析可知，FTOrs9939609突变TA/AA基因型对血糖及胰岛素抵抗产生作用，是糖尿病等代谢性疾病的易感基因型。
4 结论
（1）FTOrs9939609 TA/AA基因型被试的BMI、VFI、BC、WC、HC和UPLC显著高于TT基因型被试，表明FTOrs9939609TA/AA基因型对超重与肥胖青少年的形态与身体成分具有影响。
（2）FTOrs9939609 TA/AA基因型被试的血浆FPG、FINS水平以及HOMA-IR显著高于TT基因型被试，表明FTOrs9939609位点的A等位基因更易于发生胰岛素抵抗。
关键词：FTOSNPsrs9939609；TA/AA基因型；胰岛素抵抗；超重与肥胖；男大学生；身体形态
中图分类号：G804 文献标识码：A
文章编号：1008-2808（2015）06-0020-04
FTO基因是唯一被广泛验证的肥胖相关基因，它与人体的体脂、BMI、腰围、臀围以及血清瘦素水平等关联性最强。人类和动物研究均证实，完整的FTO基因功能对正常生理机能十分重要。2007年，Frayling与Scuteri A等证明了在FTO基因第1内含子区域的SNPs rs9939609与BMI存在显著相关。Frayling等人报道在英国FTO基因突变与儿童和成人肥胖有高度相关性，GWAS对38759名受试者的研究发现，位于FTO基因rs9939609位点单核苷酸发生的突变（该位点为单核苷酸T→A的突变）与T2MD高度相关。因此，探讨FTOrs9939609突变基因型TA/AA对超重与肥胖大学生的形态、机能和糖代谢相关指标的影响具有十分重要的临床意义。本文通过对大样本进行随机抽样150名超重与肥胖大学进行评估，以揭示基因突变对表型的影响，为该年龄段超重与肥胖青少年控制体重提供理论根据。
1 实验对象与方法
1.1 实验对象
选取上海某高校大一学生2850名，男性，汉族，年龄18-19岁。清晨空腹，进行两次测量身高、体重，通过体质量指数（BMI）=体质量/身高2（kg/㎡）公式计算出BMI。在2850名中，符合BMI≥24kg/㎡有556名，经自愿报名最后实际纳入实验人数150名，所有参与者无内分泌以及临床相关疾病史。
1.2 测试内容与方法
1.2.1 形态学指标的测量参照国民体质测量要求进行。身高、体重为仪器为SK-CK超声波体检机。围度包括腰围（WC）、臀围（HC）、胸围（BC）、大腿围（UPLC）4个部位，用皮尺测量。皮褶厚度：皮肤及皮下脂肪厚度的测量值之和，应用皮褶卡钳测量，取四个部位。（1）肱三头肌部旁：于尺骨鹰嘴与肩峰连线中点处，与上肢纵轴平行捏起皮褶；（2）肩胛部位：于肩胛下角lcm处，与脊柱夹角45°角；（3）腹部：锁骨中线与脐线平面交界处，与人体纵轴平行提捏皮褶。（4）大腿内侧：腹股沟斜线中点与同侧髌骨中点连线的中点处，皮褶方向与下肢纵轴平行。同时，收集被试的医学出生证明书，了解出生时体重和身长。内脏脂肪指数（VFI）由欧姆龙V-Body测得。
1.2.2 血样采集及处理 禁食10-12h，空腹抽取肘部肘正中静脉或者贵要静脉血，4ml置于不含抗凝剂的真空管空腹血糖、胰岛素，2ml置EDTA-K2抗凝管，-80℃保存，用于FTO基因检测。
1.2.3 FTO基因SNPrs9939609以及定点突变检测 通过全血提取白细胞，利用QIAamp DNA Minikit（Qiagen，Hilden，Germany）试剂盒提取DNA。上游引物序列为rs9939609-F：CTGGCTCTT-GAATGAAATAGGA；下游引物序列为rs9939609-R：CAGCTATTTGCATTTCAGTTTG。该引物通过在线软件Primer3设计。PCR反应体系：10×扩增缓冲液（lOul）；4种dNTP混合物（各200umol/L）；引物（各10-lOOpmol）；模板DNA（0.1-2ug）；TaqDNA聚合酶（2.5u）；Mg2+（1.5mmol/L）；加双或三蒸水至lOOul。PCR产物经虾碱酶SAP（Pro-mega，Madison，USA）和外切酶I（Epicentre，Madi-son，WI，USA）纯化后用BigDye3.1试剂盒（Ap-plied Biosystems，Foster City，CA，USA）测序，测序仪为ABI3130XL，用Polyphred软件分析，结合人工校，给出实验结果。具体实验操作步骤参照公开发表文献。
1.3 统计分析
描述性统计分别运用方差分析（连续性变量）和卡方检验（分类变量）。干预前基因型基础指标比较，用T检验分析。统计分析由9.3版SAS软件（SAS Institute Inc.，Caiy，N.C，USA）分析完成，显著性差异设定为P<0.05，非常显著设定为P<0.001。
2 实验结果
2.1 FTO rs9939609位点分型
实验结果显示，150个被试的FTOrs9939609位点全部被成功分型，重复检测100%得到验证；rs9939609位点有TT、TA与AA三个基因型，A等位基因为T→A突变。从遗传学基础研究可知FTO基因TA和AA基因型是肥胖及其相关疾病风险易感基因型（TT：正常纯合子基因型，TA：突变杂合子，AA：突变纯合子）。分析结果显示，150人中117人为正常纯合子TT，32人突变杂合子TA，1人为突变纯合子AA，T等位基因频率为88.67%，A等位基因频率为11.33%，此结果与人类基因库中中国人种比率一致（如表1）。
2.2 FTOrs9939609TT基因型与TA/AA基因型肥胖及其体脂相关指标的比较
根据（表1）结果可知：AA纯合子在本人样本中人数较少，因此在以下各个分类研究中，将TA与AA两个基因型合并，视为突变基因组。分为TT组（117人），TA/AA组（33人）。结果显示（见表2），与TT比较：TA/AA组的体重、BMI、VFI非常显著高于TT组（P<0.001），BMI平均高出2kg/㎡，VFI平均约高出3个指数点，TA/AA组的BC、WC、HC、UPLC显著高于TT组（P<0.05）。腰围平均高出4.25cm。 2.3 rs9939609TT基因型与TA/AA基因型的血糖及胰岛素抵抗的比较
实验结果显示（见表3），与TT组比较：TA/AA组的FPG、FINS、HOMA-IR显著高于TT组（P<0.05）。
3 讨论
3.1 不同rs9939609基因型对肥胖及其体脂相关指标的影响
FTO SNPs在许多血统中都与肥胖相关性状相关。研究表明FTO rs9939609是最常见、被解释最多的变异的位点，对肥胖影响作用最大。本研究结果也同样呈现rs9939609SNP对肥胖性状的影响，表现为突变TA/AA组的体重、BMI非常显著高于TT组，这与复旦大学儿科医院曹凌峰课题组研究结果一致，rs9939609TA/AA基因型儿童青少年的BMI显著高于TT基因型（P=0.0003）。另外，本研究结果还显示TA/AA基因型携带者BMI比TT基因型携带者平均高出2kg/㎡，这与一项Meta关于亚洲血统的96，551例普通人群的调查资料结果基本一致，该调查结果显示每个额外最小等位基因可以增加患肥胖风险1.25倍，同时可使BMI增加0.26kg/㎡。
rs9939609SNP对体脂分布存在影响。杨锐睿博士研究显示中学生FTO基因rs9939609TA/AA基因型比TT基因型体脂百分比显著性增高。本研究结果TA/AA携带者的BC、WC、HC、UPLC显著高于TT基因型携带者，并且TA/AA携带者的VFI非常显著高于TT基因型携带者，但是，体脂分比、出生体重、出生身高、所有皮褶厚度的未见显著性影响，表明rs9939609SNPs对内脏脂肪以及身体围度产生了影响。可能是由于FTO蛋白调控修饰的结果。FTO蛋白可调控食欲，可调控mRNA的翻译以及身体生长。FTO蛋白与大肠杆菌AlkB酶有高度的同源性，可发挥去甲基化酶功能，该蛋白可能作为转录辅助因子参与脂肪细胞的生长和发育的调控。同时，FTO风险等位基因能影响胃饥饿素mRNA的甲基化，这可能影响循环中蛋白水平，胃饥饿素是一种由胃部产生的有力促进食欲的信号蛋白。胃饥饿素信号的变化可能是FTO与BMI增加相关性的效应物。FTO基因rs9939609多态性主要影响进食后的饱足感，往往食欲更旺盛，更易发生进食失控，且偏爱高热量食物，因而导致肥胖或超重，从而引起内脏脂肪含量增加。
本研究rs9939609多态性（rs9939609SNP）对出生体重的影响与Jess T，Horikoshi M以及Kilpel-ainen T O等研究一致，没有发现FTOSNPs影响出生体重。报道显示从儿童时期，FTO对身体组成和肥胖的影响才开始，并持续到成年时期，然而在出生时，FTO基因的变异和体重和庞代恩指数不相关，其作用还没有出现，到2.5周岁开始，FTO基因的变异开始和体重、庞代恩指数相关，但是这种相关性会随着年龄逐渐减弱。
3.2 不同rs9939609基因型对血糖及胰岛素抵抗的影响
FTO突变是肥胖症及2型糖尿病的主要诱因。本研究结果显示，与TT组比较，TA/AA组的血浆FBG和FINs水平以及HOMA-IR显著高于TT组（P<0.05）。表明FTO基因突变影响了糖代谢的进行。这与以往临床研究基本一致。FTO基因能编码一种将mRNA中的mA6逆转到常规腺苷的酶引起N6-甲基腺苷水平低下。FTO基因高表达于下丘脑，因此，影响调节能量代谢和食欲，导致肥胖代谢异常。Tschritter O等FTO基因变异在中枢可引起大脑皮质的胰岛素敏感性下降，表明中枢也出现胰岛素抵抗。而在人和动物研究中还发现FTO蛋白在骨骼肌高表达，其变异后骨骼肌中的磷酸肌酸（CK）和无机盐含量容易恢复，骨骼肌细胞线粒体氧化磷酸化水平较高，并且肝脏胰岛素抵抗增高，FPG较高。Susanne等发现rs9939609SNP与胰岛素抵抗有关，每一个风险等位基因可使FPG升高3.25mμ/L，表明FTOrs9939609可能通过中枢和外周机制影响超重与肥胖者的糖代谢调节。
因此，通过分析可知，FTOrs9939609突变TA/AA基因型对血糖及胰岛素抵抗产生作用，是糖尿病等代谢性疾病的易感基因型。
4 结论
（1）FTOrs9939609 TA/AA基因型被试的BMI、VFI、BC、WC、HC和UPLC显著高于TT基因型被试，表明FTOrs9939609TA/AA基因型对超重与肥胖青少年的形态与身体成分具有影响。
（2）FTOrs9939609 TA/AA基因型被试的血浆FPG、FINS水平以及HOMA-IR显著高于TT基因型被试，表明FTOrs9939609位点的A等位基因更易于发生胰岛素抵抗。