论文部分内容阅读
【摘要】 目的 研究心房颤动时β3-肾上腺素能受体（β3-AR）是否通过作用于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶产生氧化应激。方法 建立快速心房起搏心房颤动兔模型，将40只成年家兔随机分为4组，分别为假手术组（Con组）、起搏7 d组（P7组）、β3-AR激动剂组（BRL组）和β3-AR抑制剂组（L组）。P7组、BRL组和L组在术后1周后分别给予β1-AR、β2-AR抑制剂纳多洛尔、纳多洛尔+β3-AR激动剂（BRL37344）和纳多洛尔+β3-AR抑制剂（L748337）。1周后取材，分别检测各组心房组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛和NADPH氧化酶2（NOX2）含量。结果 与Con组相比，P7组心房组织SOD活力降低（P < 0.05），丙二醛、NOX2含量增加（P均< 0.05）。给予β3-AR激动剂后，BRL组SOD活力进一步降低（P < 0.05），NOX2含量增加（P < 0.05）。給予β3-AR抑制剂后，L组SOD活力较P7组增加（P < 0.05），丙二醛含量进一步降低（P < 0.05），NOX2含量亦降低（P < 0.05）。结论 家兔快速心房起搏后心房肌发生氧化应激，激动β3-AR加重氧化应激，而抑制β3-AR后可减轻氧化应激。β3-AR可能通过NADPH氧化酶途径产生氧化应激。β3-AR和NADPH氧化酶有望成为防治心房颤动的新靶点。
【关键词】 心房颤动;氧化应激;β3-肾上腺素能受体;
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶
Roles of β3 adrenergic receptor in oxidative stress of atrial fibrillation via NADPH oxidase pathway Zhang Miaomiao， Li Weimin， Dong Jingmei. Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Harbin 150001， China
【Abstract】 Objective To explore whether β3 adrenergic receptor contributed to the oxidative stress of atrial fibrillation by NADPH oxidases in the rabbit models with rapid atrial pacing. Methods The rabbit models with rapid atrial pacing were established. Forty rabbits were randomly divided into four groups： sham operation group（Con group）， 7-d pacing group（P7 group）， β3 adrenergic receptor agonist group（BRL group）and β3 adrenergic receptor antagonist group（L group）， respectively. Nadolol， Nadolol+BRL37344 and Nadolol+L748337 were administered at postoperative 1 week in the P7， BRL and L groups， respectively. At 1 week after sample collection， superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA） and NADPH oxidase 2 （NOX2） were quantitatively measured. Results Compared with the Con group， the SOD activity was significantly decrease， whereas MDA and NOX2 levels were remarkably increased in P7 group （all P < 0.05）. The SOD activity was significantly decreased， whereas the NOX2 level was considerably increased by β3 adrenergic receptor agonist （all P < 0.05）. After the administration of β3 adrenergic receptor agonist， the SOD activity was significantly higher， whereas the MDA and NOX2 levels in the Con group were considerably declined compared with those in the P7 group （all P < 0.05）. Conclusions Oxidative stress occurs in the atrial muscle of rabbit models with rapid atrial pacing.β3 adrenergic receptor agonist can aggravate oxidative stress， whereas inhibition of β3 adrenergic receptor agonist can alleviate the oxidative stress. β3 adrenergic receptor can induce oxidative stress via the NADPH oxidases signaling pathway. β3 adrenergic receptor and NADPH oxidases probably become novel therapeutic targets for atrial fibrillation. 【Key words】 Atrial fibrillation;Oxidative stress;β3 adrenergic receptor;
Nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate oxidases
心房颤动是临床上最常见的心律失常之一。中国≥35岁居民的心房颤动患病率为0.71%，80岁以上心房颤动患病率达7.5%[1]。心房颤动可引起血栓形成，由此引发的脑卒中更是每年增加8.3%[2]。是致残致死的重要疾病之一，严重影响人们的生活质量和寿命。但目前心房颤动的发生、发展机制尚不明确，治疗主要集中于临床症状控制和后果干预，尚无有效的早期预防措施[3]。因此，深入研究心房颤动发生、发展机制及上游治疗新靶点是目前研究的重点及热点。
研究证实心房颤动与氧化应激相关，而心房颤动发生氧化应激的主要来源为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，其中心肌细胞中主要表达NADPH氧化酶2（NOX2）和NOX4[4]。动物实验证实心房颤动时NADPH氧化酶激活，并与Rac1相关。临床实验同样证实，相比于窦性心律者，心房颤动患者的心房肌NADPH氧化酶活性增加，进而Rac1蛋白表达上调[5-6]。
研究证明心房肌中β3-肾上腺素能受体（β3-AR）可影响心脏的电生理特征。通过建立家兔快速心房起搏诱发心房颤动模型进行的研究显示心房颤动模型中β3-AR表达显著增加，应用BRL37344后心房颤动诱发率和持续时间明显增加，故β3-AR与心房颤动相关。β3-AR可能通过参与氧化应激过程参与某些疾病的病理过程，Rac1可能是β3-AR的上游信号因子，而Rac1是NADPH 氧化酶的重要调节因子，故β3-AR可能通过NADPH 氧化酶产生氧化应激，参与心房颤动等相关疾病的病理过程[7-8]。本研究拟研讨心房颤动时β3-AR是否通过NADPH氧化酶产生氧化应激发挥作用，以期为心房颤动的防治寻找新靶点和相关理论依据。
材料与方法
一、主要试剂与仪器
小动物呼吸机（TKR-200C，江西省特力麻醉呼吸设备有限公司）;小动物用起搏器（600次/分，
上海复旦大学）。BRL37344（B169，Sigma-Ald-rich）;L748337（L7045，Sigma-Aldrich）;纳多洛尔（N1892，Sigma-Aldrich）。二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（P0012，Beyotime）;超氧化物歧化酶（SOD）WST-1法测定试剂盒（A001-3，南京建成）;脂质氧化丙二醛检测试剂盒（S0131，碧云天）;兔NOX2 ELISA试剂盒（E04N0091，Blue Gene）。
二、动物分组、模型构建及取材
健康成年家兔（哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心） 40只，雌雄不拘，随机分为4组：假手术组（Con组）、起搏7 d组（P7组）、β3-AR激动剂组（BRL组）和β3-AR抑制剂组（L组），每组各10只，其中后3组为起搏组。手术于家兔右心耳处缝扎双极电极，再于皮下安置小动物用起搏器，术后第1周肌肉注射青霉素1支/日以预防感染。1周后将电极与起搏器相连，起搏组给予600次/分心房快速起搏7 d，而Con组仅连接电极和起搏器不起搏。起搏组在起搏7 d内须每日缓慢静脉注射药物。P7组每日于家兔耳缘静脉处缓慢注射β1-AR、β2-AR抑制剂纳多洛尔1 mg/kg，每日2次。BRL组给予纳多洛尔，1 mg/kg，每日2次，注射完20 min后，再给予β3-AR激动剂BRL 37344，9μg/kg，每日2次。L组按照上述方法给予纳多洛尔，1 mg/kg+β3-AR抑制剂L748337，75 μg/kg，每日2次。每日对家兔进行体表心电图监测，观察起搏器是否正常工作。各组7 d后开胸后迅速修剪并留取左、右心房组织，放入液氮中速冻数分钟，取出后立即放于-80℃超低温冰箱冻存。
三、SOD活力测定
准确称取家兔心房组织质量，按质量（g）∶体积（ml）= 1∶9比例加入9倍体积的生理盐水，剪碎组织，冰水浴制成匀浆，4℃下3000转/分离心10 min，取上清即10%匀浆上清液待用。样本准備好后，先用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，然后用SOD WST-1法测定试剂盒进行样品SOD活力测定。
四、丙二醛测定
配制磷酸盐缓冲液（PBS，0.02 mol/L，pH 7.0 ～ 7.2），称取适量心房组织，向其中加入PBS，使组织重量占PBS比例为10%。冰上用匀浆器研磨组织制成组织匀浆，4℃下1600×g离心10 min，取上清液待用。应用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测上述制备的丙二醛检测样品的蛋白浓度，使用脂质氧化丙二醛检测试剂盒进行样品丙二醛含量测定。
五、NOX2测定
用预冷的PBS（0.02 mol/L，pH 7.0 ～ 7.2）清洗心房组织后称重。0.5 g组织加入1 ～ 5 ml预冷的PBS，在冰上用匀浆器研碎。用反复冻融的方法（放入液氮数分钟，取出放入37℃恒温孵育箱解冻，如此循环3 ～ 4次）裂解细胞膜，1500×g离心15 min，取上清液待用。使用兔NOX2 ELISA试剂盒进行NOX2含量测定。
六、统计学处理
采用SPSS 21.0 进行数据整理分析。计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、成功建立快速右心房起搏家兔模型
起搏前监测家兔体表心电图，显示正常窦性心律（图1A），心率约为250次/分。起搏过程中监测起搏组家兔体表心电图，显示起搏心律（图1B），心率为600次/分，证明快速心房起搏成功。 二、各组家兔心房组织SOD活力检测结果
各组心房组织SOD活力比较差异有统计学意义（F = 385.142， P < 0.05）。与Con组相比，P7组心房组织SOD活力降低（P < 0.05）。BRL组SOD活力进一步降低，且与P7组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。L组SOD活力仍较Con组降低（P < 0.05），但较P7组增加，差异有统计学意义（P < 0.05），也较BRL组增加（P < 0.05），見表1。
三、各组家兔心房组织丙二醛含量比较
各组心房组织丙二醛比较差异有统计学意义（F = 5.452， P < 0.05）。与Con组相比，P7组心房组织脂质氧化应激产物丙二醛含量增加（P = 0.011）。BRL组心房组织丙二醛含量较Con组增加（P = 0.050）。而BRL组较P7组丙二醛含量增长2.8%，有增加趋势，但差异无统计学意义（P = 0.675）。L组心房组织丙二醛含量较P7组降低（P = 0.032），对比BRL组也降低（P= 0.013），L组较Con组丙二醛含量有增加趋势，但差异无统计学意义（P = 0.622），见表1。
四、各组家兔心房组织NOX2含量比较
各组心房组织NOX2含量比较差异有统计学意义（F = 18.504， P < 0.05）。P7组心房组织NOX2含量较Con组增加（P = 0.001）。BRL组心房组织NOX2含量较Con组、P7组和L组均增加，差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。L组NOX2含量也较Con组有增加趋势，但无统计学意义（P = 0.084），较P7组NOX2含量降低（P = 0.046），见表1。
讨 论
β3-AR激动剂是含有羟基团的化合物，目前已开发数十种药物。其中BRL37344属于芳基乙醇胺类化合物，是目前已发现在人类心脏效应最强的β3-AR激动剂之一[9]。β3-AR可被经典的β肾上腺素能受体抑制剂阻断，但其特异性较低。如普萘洛尔对β1-AR、β2-AR和β3-AR作用的Ki值分别为1.8 nM、0.8 nM和186 nM。而特异性β3-AR抑制剂作用较强。但关于特异性β3-AR抑制剂的研究不多，常见的为L748337。其对人β3-AR的亲和力为4 nM，而对于β1-AR和β2-AR的亲和力分别为390 nM和204 nM，且对3种亚型均无激动作用。BRL37344 和L748337是应用最为广泛的β3-AR激动剂和抑制剂，它们均对β3-AR具有较高亲和力，且对β1-AR或β2-AR的特异性不强[10]。具体给药剂量参考已发表的类似实验，结合实验对象家兔的特点，最终拟定给药剂量BRL37344为9 μg/kg，L748337为75 μg/kg，每日2次，缓慢静脉注射给药[10-11]。且为排除β1-AR和β2-AR的潜在作用对实验结果的干扰，在给β3-AR激动剂和抑制剂前20 min给予β1-AR、β2-AR抑制剂纳多洛尔1 mg/kg，纳多洛尔的半衰期长达17 ～ 24 h，是长效β1-AR、β2-AR抑制剂，可保证长期阻滞β1-AR或β2-AR。并且对β3-AR表现为低亲和力，不会和BRL37344 和L748337共同竞争β3-AR，排除其干扰[12]。
已有研究证实β3-AR与心房颤动相关。但具体作用机制尚不明确。有研究发现快速心房起搏后可引起犬心房β3-AR蛋白和mRNA表达上调，并存在心房结构重构[10]。激活β3-AR能促进心房结构重构，而应用β3-AR抑制剂则可改善心房结构重构。并证实β3-AR可能通过MAPKs信号通路参与心房颤动心房结构重构。另有研究同样证实快速心房起搏家兔的心房肌β3-AR表达上调，并发现β3-AR激动导致房颤心房肌能量代谢异常加重，阻滞该受体后可减轻代谢重构，保护心脏[11]。β3-AR可能通过PPARɑ/PGC-1ɑ影响心房颤动心房能量代谢。故β3-AR在心房颤动发生、发展中起着重要作用，可能参与了心房的代谢重构、结构重构等[13]。
本实验进一步证实β3-AR与心房颤动氧化应激相关。β3-AR激活使心房颤动氧化应激恶化，β3-AR抑制剂改善心房颤动氧化应激。快速心房起搏模型中应用β3-AR激动剂使心房肌SOD活力进一步降低，应用β3-AR抑制剂使心房肌SOD活力较P7组增加。另对丙二醛的检测显示，应用β3-AR抑制剂可使丙二醛含量较单纯起搏组显著下降，改善氧化应激。虽然应用BRL37344后丙二醛含量较P7组改变没有统计学意义，但均值增长2.8%，有增长趋势，且BRL组与L组间丙二醛差异具有统计学意义，说明激动或抑制β3-AR影响心房颤动氧化应激。L组的SOD活力较Con组减少，而丙二醛含量与Con组间差异不具有统计学意义，这可能与实验中各组例数相对较少有关。可增加各组例数进行进一步实验验证。
目前大多研究证实常规抗氧化治疗对心房颤动并无明确效果，以NADPH氧化酶为靶点的治疗受到广泛关注[14]。在孵育的牛的主动脉内皮细胞上证实肾上腺素可激活小G蛋白Rac1。采用Rac1敲除阻断了β3-AR-eNOS信号通路，也消除了肾上腺素依赖的蛋白激酶A（PKA）的激活。而siRNA介导的PKA 敲除不影响β3-AR对Rac1的激活。这些发现提示，Rac1是β3-AR信号通路的上游调节因子，并且证实了β3-AR-Rac1-PKA信号通路[15]。而Rac1是NADPH氧化酶的重要调节因子，故推测β3-AR也通过NADPH氧化酶发生氧化应激作用。NADPH氧化酶是由多个亚基组成的酶复合体。存在多个同工酶，在心肌中主要表达的是NOX2和NOX4[16]。关于NOX4的研究较少，其作用多与H2O2信号通路有关。而NOX2在心房组织产生氧化应激的过程中发挥了主要作用，故本实验通过检测心房组织内NOX2的含量来研究NADPH氧化酶的作用[17]。本研究证实，心房颤动时兔心房肌NOX2含量增加，表明心房颤动时存在NOX2的改变。且给予β3-AR激动剂后NOX2含量进一步增加，阻断β3-AR后较P7组含量降低。证明β3-AR与心房肌NOX2相关，结合之前的SOD和丙二醛的结果，推测心房颤动时β3-AR通过NADPH氧化酶产生氧化应激，实验结果符合预期。 目前β3-AR與心房颤动的研究多集中于动物实验，临床实验则陆续展开。张梓桑等[18]选取35例阵发性心房颤动患者、33例持续性心房颤动患者、30例永久性心房颤动患者和31名门诊健康体检成年人作为对照组进行研究，收集外周血并检测淋巴细胞β3-AR信使核糖核酸（mRNA）的表达量。研究显示心房颤动组β3-AR mRNA表达水平高于对照组。阵发性心房颤动、持续性心房颤动和永久性心房颤动患者的β3-AR mRNA相对表达水平组间比较差异均有统计学意义。β3-AR mRNA相对表达水平与左心房内径呈正相关。多因素Logistic回归分析显示，β3-AR mRNA相对表达水平与心房颤动相关。受试者工作特征曲线显示，β3-AR mRNA相对表达水平预测心房颤动的曲线下面积为0.734（95%CI：0.639 ～ 0.829，P < 0.05）。故人体β3-AR表达也与心房颤动相关，但心房颤动发生机制复杂，多种危险因素可导致心房颤动发生，如高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、风湿性心脏病等，不同的病因可能存在不同的心房颤动发生机制，β3-AR是否在其中均起到了作用，尚需进行更多相关研究。
综上所述，构建的家兔心房颤动模型心房肌存在氧化应激，激动β3-AR加重氧化应激，而抑制β3-AR后可减轻氧化应激。β3-AR可能通过NADPH氧化酶途径产生氧化应激。β3-AR和NADPH氧化酶有望成为防治心房颤动的新靶点。当然，本研究尚需扩大样本量进一步研究β3-AR-Rac1-PKA信号通路在房颤氧化应激中的作用。
参 考 文 献
[1] Wang Z， Chen Z， Wang X， Zhang L， Li S， Tian Y， Shao L， Hu H， Gao R; for China Hypertension Survey Group. The disease burden of atrial fibrillation in China from a national cross-sectional survey. Am J Cardiol， 2018， 122（5）： 793-798.
[2] 胡盛寿， 高润霖， 刘力生， 朱曼璐，王文，王拥军，吴兆苏，李惠君，顾东风，杨跃进，郑哲，陈伟伟. 《中国心血管病报告2018》概要.中国循环杂志，2019，34（3）：209-220.
[3] 王业松. 慢性心房颤动的治疗.新医学，2013，44（1）：3-7.
[4] 张苗苗， 李为民. 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与心房颤动的研究.国际心血管病杂志，2014，41（4）：217-219.
[5] Ren X， Wang X， Yuan M， Tian C， Li H， Yang X， Li X， Li Y， Yang Y， Liu N， Shang H， Gao Y， Xing Y. Mechanisms and treatments of oxidative stress in atrial fibrillation. Curr Pharm Des， 2018，24（26）：3062-3071.
[6] Sahoo S， Meijles DN， Pagano PJ. NADPH oxidases： key modulators in aging and age-related cardiovascular diseases？ Clin Sci （Lond）， 2016，130（5）：317-335.
[7] 田静朴， 王小兵， 李为民. β3肾上腺素能受体与心房颤动心肌代谢重构的研究进展.心脏杂志，2016，28（5）：616-619.
[8] Wang X， Wang R， Liu G， Dong J， Zhao G， Tian J， Sun J， Jia X， Wei L， Wang Y， Li W.The β3 adrenergic receptor agonist BRL37344 exacerbates atrial structural remodeling through iNOS uncoupling in canine models of atrial fibrillation.Cell Physiol Biochem，2016，38（2）：514-530.
[9] 张梓桑， 张薪茹， 李光宇， 张劲松，杜荣增. β3肾上腺素受体与心血管疾病相关性的研究进展.中国动脉硬化杂志，2018，26（2）：207-212.
[10] Sheng L， Shen Q， Huang K， Liu G， Zhao J， Xu W， Liu Y， Li W， Li Y. Upregulation of β3-adrenergic receptors contributes to atrial structural remodeling in rapid pacing induced atrial fibrillation canines.Cell Physiol Biochem，2012，30（2）：372-381.
[11] Liu Y， Geng J， Liu Y， Li Y， Shen J， Xiao X， Sheng L， Yang B， Cheng C， Li W.β3-adrenoceptor mediates metabolic protein remodeling in a rabbit model of tachypacing-induced atrial fibrillation.Cell Physiol Biochem， 2013， 32（6）： 1631-1642.
[12] Dong J， Zhao J， Zhang M， Liu G， Wang X， Liu Y， Yang N， Liu Y， Zhao G， Sun J， Tian J， Cheng C， Wei L， Li Y， Li W. β3-adrenoceptor impairs mitochondrial biogenesis and energy metabolism during rapid atrial pacing-induced atrial fibrillation.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2016，21（1）：114-126. [13] Li X， Yang X， Li Y， Yuan M， Tian C， Yang Y， Zhang X， Liu C， Gao Y， Liu N， Shang H， Xing Y. Mitochondria and the pathophysiological mechanism of atrial fibrillation. Curr Pharm Des， 2018，24（26）：3055-3061.
[14] Barangi S， Hayes AW， Karimi G. The more effective treatment of atrial fibrillation applying the natural compounds; as NADPH oxidase and ion channel inhibitors. Crit Rev Food Sci Nutr， 2018，58（7）：1230-1241.
[15] Barr LA， Lambert JP， Shimizu Y， Barouch LA， Naqvi N， Calvert JW. Exercise training provides cardioprotection by activating and coupling endothelial nitric oxide synthase via a β3-adrenergic receptor-AMP-activated protein kinase signaling pathway. Med Gas Res，2017，7（1）：1-8.
[16] Schena G， Caplan MJ. Everything you always wanted to know about β3-AR * （* but were afraid to ask）.Cells，2019，8（4）. pii： E357.
[17] 郭海燕， 杨静， 富路. 抑制NADPH氧化酶对心血管疾病保护作用研究进展.中华实用诊断与治疗杂志，2016，30（10）：953-955.
[18] 张梓桑， 张薪茹， 张庄， 李光宇，张劲松，杜荣增. 心房颤动患者外周血淋巴细胞β3肾上腺素受體的表达水平及临床意义.中国循环杂志，2019，34（4）：363-369.
（收稿日期：2019-06-19）
（本文编辑：杨江瑜）
【关键词】 心房颤动;氧化应激;β3-肾上腺素能受体;
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶
Roles of β3 adrenergic receptor in oxidative stress of atrial fibrillation via NADPH oxidase pathway Zhang Miaomiao， Li Weimin， Dong Jingmei. Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Harbin 150001， China
【Abstract】 Objective To explore whether β3 adrenergic receptor contributed to the oxidative stress of atrial fibrillation by NADPH oxidases in the rabbit models with rapid atrial pacing. Methods The rabbit models with rapid atrial pacing were established. Forty rabbits were randomly divided into four groups： sham operation group（Con group）， 7-d pacing group（P7 group）， β3 adrenergic receptor agonist group（BRL group）and β3 adrenergic receptor antagonist group（L group）， respectively. Nadolol， Nadolol+BRL37344 and Nadolol+L748337 were administered at postoperative 1 week in the P7， BRL and L groups， respectively. At 1 week after sample collection， superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA） and NADPH oxidase 2 （NOX2） were quantitatively measured. Results Compared with the Con group， the SOD activity was significantly decrease， whereas MDA and NOX2 levels were remarkably increased in P7 group （all P < 0.05）. The SOD activity was significantly decreased， whereas the NOX2 level was considerably increased by β3 adrenergic receptor agonist （all P < 0.05）. After the administration of β3 adrenergic receptor agonist， the SOD activity was significantly higher， whereas the MDA and NOX2 levels in the Con group were considerably declined compared with those in the P7 group （all P < 0.05）. Conclusions Oxidative stress occurs in the atrial muscle of rabbit models with rapid atrial pacing.β3 adrenergic receptor agonist can aggravate oxidative stress， whereas inhibition of β3 adrenergic receptor agonist can alleviate the oxidative stress. β3 adrenergic receptor can induce oxidative stress via the NADPH oxidases signaling pathway. β3 adrenergic receptor and NADPH oxidases probably become novel therapeutic targets for atrial fibrillation. 【Key words】 Atrial fibrillation;Oxidative stress;β3 adrenergic receptor;
Nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate oxidases
心房颤动是临床上最常见的心律失常之一。中国≥35岁居民的心房颤动患病率为0.71%，80岁以上心房颤动患病率达7.5%[1]。心房颤动可引起血栓形成，由此引发的脑卒中更是每年增加8.3%[2]。是致残致死的重要疾病之一，严重影响人们的生活质量和寿命。但目前心房颤动的发生、发展机制尚不明确，治疗主要集中于临床症状控制和后果干预，尚无有效的早期预防措施[3]。因此，深入研究心房颤动发生、发展机制及上游治疗新靶点是目前研究的重点及热点。
研究证实心房颤动与氧化应激相关，而心房颤动发生氧化应激的主要来源为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，其中心肌细胞中主要表达NADPH氧化酶2（NOX2）和NOX4[4]。动物实验证实心房颤动时NADPH氧化酶激活，并与Rac1相关。临床实验同样证实，相比于窦性心律者，心房颤动患者的心房肌NADPH氧化酶活性增加，进而Rac1蛋白表达上调[5-6]。
研究证明心房肌中β3-肾上腺素能受体（β3-AR）可影响心脏的电生理特征。通过建立家兔快速心房起搏诱发心房颤动模型进行的研究显示心房颤动模型中β3-AR表达显著增加，应用BRL37344后心房颤动诱发率和持续时间明显增加，故β3-AR与心房颤动相关。β3-AR可能通过参与氧化应激过程参与某些疾病的病理过程，Rac1可能是β3-AR的上游信号因子，而Rac1是NADPH 氧化酶的重要调节因子，故β3-AR可能通过NADPH 氧化酶产生氧化应激，参与心房颤动等相关疾病的病理过程[7-8]。本研究拟研讨心房颤动时β3-AR是否通过NADPH氧化酶产生氧化应激发挥作用，以期为心房颤动的防治寻找新靶点和相关理论依据。
材料与方法
一、主要试剂与仪器
小动物呼吸机（TKR-200C，江西省特力麻醉呼吸设备有限公司）;小动物用起搏器（600次/分，
上海复旦大学）。BRL37344（B169，Sigma-Ald-rich）;L748337（L7045，Sigma-Aldrich）;纳多洛尔（N1892，Sigma-Aldrich）。二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（P0012，Beyotime）;超氧化物歧化酶（SOD）WST-1法测定试剂盒（A001-3，南京建成）;脂质氧化丙二醛检测试剂盒（S0131，碧云天）;兔NOX2 ELISA试剂盒（E04N0091，Blue Gene）。
二、动物分组、模型构建及取材
健康成年家兔（哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心） 40只，雌雄不拘，随机分为4组：假手术组（Con组）、起搏7 d组（P7组）、β3-AR激动剂组（BRL组）和β3-AR抑制剂组（L组），每组各10只，其中后3组为起搏组。手术于家兔右心耳处缝扎双极电极，再于皮下安置小动物用起搏器，术后第1周肌肉注射青霉素1支/日以预防感染。1周后将电极与起搏器相连，起搏组给予600次/分心房快速起搏7 d，而Con组仅连接电极和起搏器不起搏。起搏组在起搏7 d内须每日缓慢静脉注射药物。P7组每日于家兔耳缘静脉处缓慢注射β1-AR、β2-AR抑制剂纳多洛尔1 mg/kg，每日2次。BRL组给予纳多洛尔，1 mg/kg，每日2次，注射完20 min后，再给予β3-AR激动剂BRL 37344，9μg/kg，每日2次。L组按照上述方法给予纳多洛尔，1 mg/kg+β3-AR抑制剂L748337，75 μg/kg，每日2次。每日对家兔进行体表心电图监测，观察起搏器是否正常工作。各组7 d后开胸后迅速修剪并留取左、右心房组织，放入液氮中速冻数分钟，取出后立即放于-80℃超低温冰箱冻存。
三、SOD活力测定
准确称取家兔心房组织质量，按质量（g）∶体积（ml）= 1∶9比例加入9倍体积的生理盐水，剪碎组织，冰水浴制成匀浆，4℃下3000转/分离心10 min，取上清即10%匀浆上清液待用。样本准備好后，先用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，然后用SOD WST-1法测定试剂盒进行样品SOD活力测定。
四、丙二醛测定
配制磷酸盐缓冲液（PBS，0.02 mol/L，pH 7.0 ～ 7.2），称取适量心房组织，向其中加入PBS，使组织重量占PBS比例为10%。冰上用匀浆器研磨组织制成组织匀浆，4℃下1600×g离心10 min，取上清液待用。应用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测上述制备的丙二醛检测样品的蛋白浓度，使用脂质氧化丙二醛检测试剂盒进行样品丙二醛含量测定。
五、NOX2测定
用预冷的PBS（0.02 mol/L，pH 7.0 ～ 7.2）清洗心房组织后称重。0.5 g组织加入1 ～ 5 ml预冷的PBS，在冰上用匀浆器研碎。用反复冻融的方法（放入液氮数分钟，取出放入37℃恒温孵育箱解冻，如此循环3 ～ 4次）裂解细胞膜，1500×g离心15 min，取上清液待用。使用兔NOX2 ELISA试剂盒进行NOX2含量测定。
六、统计学处理
采用SPSS 21.0 进行数据整理分析。计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、成功建立快速右心房起搏家兔模型
起搏前监测家兔体表心电图，显示正常窦性心律（图1A），心率约为250次/分。起搏过程中监测起搏组家兔体表心电图，显示起搏心律（图1B），心率为600次/分，证明快速心房起搏成功。 二、各组家兔心房组织SOD活力检测结果
各组心房组织SOD活力比较差异有统计学意义（F = 385.142， P < 0.05）。与Con组相比，P7组心房组织SOD活力降低（P < 0.05）。BRL组SOD活力进一步降低，且与P7组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。L组SOD活力仍较Con组降低（P < 0.05），但较P7组增加，差异有统计学意义（P < 0.05），也较BRL组增加（P < 0.05），見表1。
三、各组家兔心房组织丙二醛含量比较
各组心房组织丙二醛比较差异有统计学意义（F = 5.452， P < 0.05）。与Con组相比，P7组心房组织脂质氧化应激产物丙二醛含量增加（P = 0.011）。BRL组心房组织丙二醛含量较Con组增加（P = 0.050）。而BRL组较P7组丙二醛含量增长2.8%，有增加趋势，但差异无统计学意义（P = 0.675）。L组心房组织丙二醛含量较P7组降低（P = 0.032），对比BRL组也降低（P= 0.013），L组较Con组丙二醛含量有增加趋势，但差异无统计学意义（P = 0.622），见表1。
四、各组家兔心房组织NOX2含量比较
各组心房组织NOX2含量比较差异有统计学意义（F = 18.504， P < 0.05）。P7组心房组织NOX2含量较Con组增加（P = 0.001）。BRL组心房组织NOX2含量较Con组、P7组和L组均增加，差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。L组NOX2含量也较Con组有增加趋势，但无统计学意义（P = 0.084），较P7组NOX2含量降低（P = 0.046），见表1。
讨 论
β3-AR激动剂是含有羟基团的化合物，目前已开发数十种药物。其中BRL37344属于芳基乙醇胺类化合物，是目前已发现在人类心脏效应最强的β3-AR激动剂之一[9]。β3-AR可被经典的β肾上腺素能受体抑制剂阻断，但其特异性较低。如普萘洛尔对β1-AR、β2-AR和β3-AR作用的Ki值分别为1.8 nM、0.8 nM和186 nM。而特异性β3-AR抑制剂作用较强。但关于特异性β3-AR抑制剂的研究不多，常见的为L748337。其对人β3-AR的亲和力为4 nM，而对于β1-AR和β2-AR的亲和力分别为390 nM和204 nM，且对3种亚型均无激动作用。BRL37344 和L748337是应用最为广泛的β3-AR激动剂和抑制剂，它们均对β3-AR具有较高亲和力，且对β1-AR或β2-AR的特异性不强[10]。具体给药剂量参考已发表的类似实验，结合实验对象家兔的特点，最终拟定给药剂量BRL37344为9 μg/kg，L748337为75 μg/kg，每日2次，缓慢静脉注射给药[10-11]。且为排除β1-AR和β2-AR的潜在作用对实验结果的干扰，在给β3-AR激动剂和抑制剂前20 min给予β1-AR、β2-AR抑制剂纳多洛尔1 mg/kg，纳多洛尔的半衰期长达17 ～ 24 h，是长效β1-AR、β2-AR抑制剂，可保证长期阻滞β1-AR或β2-AR。并且对β3-AR表现为低亲和力，不会和BRL37344 和L748337共同竞争β3-AR，排除其干扰[12]。
已有研究证实β3-AR与心房颤动相关。但具体作用机制尚不明确。有研究发现快速心房起搏后可引起犬心房β3-AR蛋白和mRNA表达上调，并存在心房结构重构[10]。激活β3-AR能促进心房结构重构，而应用β3-AR抑制剂则可改善心房结构重构。并证实β3-AR可能通过MAPKs信号通路参与心房颤动心房结构重构。另有研究同样证实快速心房起搏家兔的心房肌β3-AR表达上调，并发现β3-AR激动导致房颤心房肌能量代谢异常加重，阻滞该受体后可减轻代谢重构，保护心脏[11]。β3-AR可能通过PPARɑ/PGC-1ɑ影响心房颤动心房能量代谢。故β3-AR在心房颤动发生、发展中起着重要作用，可能参与了心房的代谢重构、结构重构等[13]。
本实验进一步证实β3-AR与心房颤动氧化应激相关。β3-AR激活使心房颤动氧化应激恶化，β3-AR抑制剂改善心房颤动氧化应激。快速心房起搏模型中应用β3-AR激动剂使心房肌SOD活力进一步降低，应用β3-AR抑制剂使心房肌SOD活力较P7组增加。另对丙二醛的检测显示，应用β3-AR抑制剂可使丙二醛含量较单纯起搏组显著下降，改善氧化应激。虽然应用BRL37344后丙二醛含量较P7组改变没有统计学意义，但均值增长2.8%，有增长趋势，且BRL组与L组间丙二醛差异具有统计学意义，说明激动或抑制β3-AR影响心房颤动氧化应激。L组的SOD活力较Con组减少，而丙二醛含量与Con组间差异不具有统计学意义，这可能与实验中各组例数相对较少有关。可增加各组例数进行进一步实验验证。
目前大多研究证实常规抗氧化治疗对心房颤动并无明确效果，以NADPH氧化酶为靶点的治疗受到广泛关注[14]。在孵育的牛的主动脉内皮细胞上证实肾上腺素可激活小G蛋白Rac1。采用Rac1敲除阻断了β3-AR-eNOS信号通路，也消除了肾上腺素依赖的蛋白激酶A（PKA）的激活。而siRNA介导的PKA 敲除不影响β3-AR对Rac1的激活。这些发现提示，Rac1是β3-AR信号通路的上游调节因子，并且证实了β3-AR-Rac1-PKA信号通路[15]。而Rac1是NADPH氧化酶的重要调节因子，故推测β3-AR也通过NADPH氧化酶发生氧化应激作用。NADPH氧化酶是由多个亚基组成的酶复合体。存在多个同工酶，在心肌中主要表达的是NOX2和NOX4[16]。关于NOX4的研究较少，其作用多与H2O2信号通路有关。而NOX2在心房组织产生氧化应激的过程中发挥了主要作用，故本实验通过检测心房组织内NOX2的含量来研究NADPH氧化酶的作用[17]。本研究证实，心房颤动时兔心房肌NOX2含量增加，表明心房颤动时存在NOX2的改变。且给予β3-AR激动剂后NOX2含量进一步增加，阻断β3-AR后较P7组含量降低。证明β3-AR与心房肌NOX2相关，结合之前的SOD和丙二醛的结果，推测心房颤动时β3-AR通过NADPH氧化酶产生氧化应激，实验结果符合预期。 目前β3-AR與心房颤动的研究多集中于动物实验，临床实验则陆续展开。张梓桑等[18]选取35例阵发性心房颤动患者、33例持续性心房颤动患者、30例永久性心房颤动患者和31名门诊健康体检成年人作为对照组进行研究，收集外周血并检测淋巴细胞β3-AR信使核糖核酸（mRNA）的表达量。研究显示心房颤动组β3-AR mRNA表达水平高于对照组。阵发性心房颤动、持续性心房颤动和永久性心房颤动患者的β3-AR mRNA相对表达水平组间比较差异均有统计学意义。β3-AR mRNA相对表达水平与左心房内径呈正相关。多因素Logistic回归分析显示，β3-AR mRNA相对表达水平与心房颤动相关。受试者工作特征曲线显示，β3-AR mRNA相对表达水平预测心房颤动的曲线下面积为0.734（95%CI：0.639 ～ 0.829，P < 0.05）。故人体β3-AR表达也与心房颤动相关，但心房颤动发生机制复杂，多种危险因素可导致心房颤动发生，如高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、风湿性心脏病等，不同的病因可能存在不同的心房颤动发生机制，β3-AR是否在其中均起到了作用，尚需进行更多相关研究。
综上所述，构建的家兔心房颤动模型心房肌存在氧化应激，激动β3-AR加重氧化应激，而抑制β3-AR后可减轻氧化应激。β3-AR可能通过NADPH氧化酶途径产生氧化应激。β3-AR和NADPH氧化酶有望成为防治心房颤动的新靶点。当然，本研究尚需扩大样本量进一步研究β3-AR-Rac1-PKA信号通路在房颤氧化应激中的作用。
参 考 文 献
[1] Wang Z， Chen Z， Wang X， Zhang L， Li S， Tian Y， Shao L， Hu H， Gao R; for China Hypertension Survey Group. The disease burden of atrial fibrillation in China from a national cross-sectional survey. Am J Cardiol， 2018， 122（5）： 793-798.
[2] 胡盛寿， 高润霖， 刘力生， 朱曼璐，王文，王拥军，吴兆苏，李惠君，顾东风，杨跃进，郑哲，陈伟伟. 《中国心血管病报告2018》概要.中国循环杂志，2019，34（3）：209-220.
[3] 王业松. 慢性心房颤动的治疗.新医学，2013，44（1）：3-7.
[4] 张苗苗， 李为民. 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶与心房颤动的研究.国际心血管病杂志，2014，41（4）：217-219.
[5] Ren X， Wang X， Yuan M， Tian C， Li H， Yang X， Li X， Li Y， Yang Y， Liu N， Shang H， Gao Y， Xing Y. Mechanisms and treatments of oxidative stress in atrial fibrillation. Curr Pharm Des， 2018，24（26）：3062-3071.
[6] Sahoo S， Meijles DN， Pagano PJ. NADPH oxidases： key modulators in aging and age-related cardiovascular diseases？ Clin Sci （Lond）， 2016，130（5）：317-335.
[7] 田静朴， 王小兵， 李为民. β3肾上腺素能受体与心房颤动心肌代谢重构的研究进展.心脏杂志，2016，28（5）：616-619.
[8] Wang X， Wang R， Liu G， Dong J， Zhao G， Tian J， Sun J， Jia X， Wei L， Wang Y， Li W.The β3 adrenergic receptor agonist BRL37344 exacerbates atrial structural remodeling through iNOS uncoupling in canine models of atrial fibrillation.Cell Physiol Biochem，2016，38（2）：514-530.
[9] 张梓桑， 张薪茹， 李光宇， 张劲松，杜荣增. β3肾上腺素受体与心血管疾病相关性的研究进展.中国动脉硬化杂志，2018，26（2）：207-212.
[10] Sheng L， Shen Q， Huang K， Liu G， Zhao J， Xu W， Liu Y， Li W， Li Y. Upregulation of β3-adrenergic receptors contributes to atrial structural remodeling in rapid pacing induced atrial fibrillation canines.Cell Physiol Biochem，2012，30（2）：372-381.
[11] Liu Y， Geng J， Liu Y， Li Y， Shen J， Xiao X， Sheng L， Yang B， Cheng C， Li W.β3-adrenoceptor mediates metabolic protein remodeling in a rabbit model of tachypacing-induced atrial fibrillation.Cell Physiol Biochem， 2013， 32（6）： 1631-1642.
[12] Dong J， Zhao J， Zhang M， Liu G， Wang X， Liu Y， Yang N， Liu Y， Zhao G， Sun J， Tian J， Cheng C， Wei L， Li Y， Li W. β3-adrenoceptor impairs mitochondrial biogenesis and energy metabolism during rapid atrial pacing-induced atrial fibrillation.J Cardiovasc Pharmacol Ther，2016，21（1）：114-126. [13] Li X， Yang X， Li Y， Yuan M， Tian C， Yang Y， Zhang X， Liu C， Gao Y， Liu N， Shang H， Xing Y. Mitochondria and the pathophysiological mechanism of atrial fibrillation. Curr Pharm Des， 2018，24（26）：3055-3061.
[14] Barangi S， Hayes AW， Karimi G. The more effective treatment of atrial fibrillation applying the natural compounds; as NADPH oxidase and ion channel inhibitors. Crit Rev Food Sci Nutr， 2018，58（7）：1230-1241.
[15] Barr LA， Lambert JP， Shimizu Y， Barouch LA， Naqvi N， Calvert JW. Exercise training provides cardioprotection by activating and coupling endothelial nitric oxide synthase via a β3-adrenergic receptor-AMP-activated protein kinase signaling pathway. Med Gas Res，2017，7（1）：1-8.
[16] Schena G， Caplan MJ. Everything you always wanted to know about β3-AR * （* but were afraid to ask）.Cells，2019，8（4）. pii： E357.
[17] 郭海燕， 杨静， 富路. 抑制NADPH氧化酶对心血管疾病保护作用研究进展.中华实用诊断与治疗杂志，2016，30（10）：953-955.
[18] 张梓桑， 张薪茹， 张庄， 李光宇，张劲松，杜荣增. 心房颤动患者外周血淋巴细胞β3肾上腺素受體的表达水平及临床意义.中国循环杂志，2019，34（4）：363-369.
（收稿日期：2019-06-19）
（本文编辑：杨江瑜）