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摘 要：从福建某发病规模猪场保育猪的肺脏中分离到1株细菌，根据分离细菌的形态观察、生化试验、培养特性、PCR鉴定和动物攻毒试验，结合发病猪的临床症状和病理变化，表明该分离菌为偏向厌氧型链球菌，具有在血平板上培养良好且能致小白鼠发病死亡等特性。药敏试验表明：分离链球菌对万古霉素、亚胺培南、利奈唑胺和菌必治高度敏感，对阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻肟、呋喃妥因和替加环素中度敏感，对卡多西环素、多粘菌素、青霉素、链霉素、恩诺沙星等药物不敏感。猪场根据藥敏结果，采取紧急防治措施，疫情5 d后得到有效控制。
关键词：猪链球菌;分离鉴定;防治
中图分类号：S 852.61 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）07-0026-04
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.004
Isolation， Identification and Prevention of a Strain of Streptococcus Suis
WANG Longbai1， ZHENG Liying2， CHEN Qiuyong1， WU Xuemin1，CHEN Rujing1， CHE Yongliang1， ZHOU Lunjiang1*
（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Fujian Academy of Agricultural
Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China; 2. Yanping District Center of Animal
Disease Prevention and Control， Nanping， Fujian 353000， China）
Abstract： A bacterial strain was isolated from the lungs of weaned pigs in the infected intensive pig farm in Fujian Province. According to the morphological observation， biochemical test， cultural characteristics， PCR identification and animal challenge test of the isolated bacteria， and combined with the clinical symptoms and pathological changes of the infected pigs， it was indicated that the isolated bacteria was partial to anaerobic Streptococcus， which had the characteristics of good culture on blood plate and could cause the disease and death of mice. The drug sensitivity test showed that the isolated Streptococcus was highly sensitive to vancomycin， imipenem， linezolid and rocephin， and was moderately sensitive to amoxicillin， florfenicol， cefotaxime， macrodantin and tigecycline， while was not sensitive to the drugs such as cardoxycycline， polymyxin， penicillin， streptomycin， and enrofloxacin. According to the results of drug sensitivity， the pig farm should take emergency prevention and control measures， and the epidemic could be effectively controlled 5 days later.
Key words： Streptococcus suis; Isolation and identification; Prevention and treatment
自2018年我国首次报道发生非洲猪瘟以来，各规模养殖场都强化了生物安全防控措施和疫病综合防控举措，猪场发生病毒性传染病（如猪流行性腹泻、圆环病毒病等）的情况有所减少。但由于如今在饲料中全面禁抗和对细菌性疾病防控的疏忽[1]，导致发生猪细菌性的疾病有所增加，比如胀气梭菌和猪链菌病等。猪链球菌病（Strep tococcosis swine ）是由不同群的链球菌引起的不同临床症状传染病的总称[2]。该病病原主要为C群的兽疫链球菌及类马链球菌、D群的猪链球菌、以及E、L、S、R等群[3]，一年四季均可发生，但在闷热潮湿的天气更多发。根究猪群感染链球菌的临床表现，可分为脑膜炎型、败血型、化脓性关节炎型及淋巴结炎型等[4]。
2020年8月，福建某存栏约600头母猪的规模猪场，保育猪出现发病和死亡，发病率达30%，死亡率达12%，临床症状主要表现为食欲减退、体温升高、呼吸困难和个别头往后仰等神经症状;经实验室对病料进行细菌分离鉴定，及对分离菌的形态学观察、生化和PCR鉴定、动物攻毒和药敏试验，证实分离到1株猪链球菌。猪场根据诊治结果，采取紧急防控措施，疫情最终获得有效控制。 1 材料与方法
1.1 试验材料
2头疑似发病保育猪的肺脏来源于福建某发病规模猪场;普通琼脂板、绵羊血琼脂平板和麦康凯琼脂平板由福建省农业科学院畜牧兽医研究所自制;革兰氏染色试剂和生化试剂购自广东环凯微生物科技有限公司;药敏试纸购自北京天坛药物生物技术开发有限公司;昆明小白鼠购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌分离培养 在超净台内用细菌接种针在病死猪肺脏划线接种于血琼脂平板，然后放置在37℃的培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况。选取单个菌落进行革兰氏染色后观察细菌的形态特点。
1.2.2 细菌培养特征 将分离菌接种于血琼脂平板、麦康凯琼脂平板和普通琼脂平板各2组，分别放置于有氧和厌氧环境下培养，观察细菌的生长情况。
1.2.3 细菌生化鉴定 按生化试剂盒说明书进行细菌生化鉴定。将细菌分别接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、肌醇、木糖、鼠李糖、棉仔糖、硫化氢、靛基质等生化鉴定管中，培养18～24 h观察生化鉴定结果。
1.2.4 细菌PCR鉴定 按参考文献[5]进行。根据猪链球菌16S rRNA设计引物，扩增片段长度为688 bp。
1.2.5 动物攻毒试验 将8只昆明小白鼠，分成2组，分别为试验组和对照组各4头。试验组通过腹腔接种分离菌液（1×107 CFU·mL-1）0.2 mL·只
-1，对照组每只分别注射等剂量的生理盐水。两组分别隔离饲养观察。
1.2.6 药敏试验 采用药敏纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验，取100 μL细菌液（1×107 CFU·mL-1）涂布于血平板培养基，在培养基面貼上不同药敏纸片，置于37℃培养24 h后，按说明判定标准对结果进行分析。
2 结果与分析
2.1 发病猪临床症状和病理变化
发病猪只的临床症状主要表现为食欲不振或废绝，精神沉郁（图1），体温为40～42℃，鼻腔有浆性鼻汁流出，腹式呼吸，个别出现运动失调，四肢划水，头往后仰等神经症状，濒死体温下降;病理变化主要表现为肺脏出血、肉变（图2）和脑膜充血，淋巴结肿大、出血，肾脏有出血点。
2.2 细菌形态学观察
从病料的肺脏中分离到1株细菌，该细菌在鲜血琼脂平板上培养18～24 h后，长出半透明、圆形、光滑、边缘整齐的溶血性菌落（图3）;革兰氏染色阳性，菌体呈圆形，短链，主要以5～18个菌体链状排列，可见单个长达20个以上菌体相连的长链状（图4）。
2.3 细菌培养特征
经不同培养基和不同环境下培养发现，该菌在麦康凯琼脂平板无论是在厌氧还是在有氧条件下都不能生长，在普通琼脂平板可生长、鲜血平板培养在厌氧比有氧条件下生长更好。
2.4 细菌生化鉴定
培养18 h后观察生化鉴定结果，发现该菌可发酵蔗糖、果糖、肌醇、葡萄糖和乳糖;不能发酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖、麦芽糖、木糖、硫化氢、棉仔糖和靛基质;以上生化鉴定符合链球菌生化特性。
2.5 细菌PCR鉴定
分离菌经PCR反应，获得大约688 bp大小的目的条带，与预期大小一致（图5）。
2.6 动物攻毒试验
分离细菌接种小白鼠12 h后，开始出现活动减少、精神沉郁、被毛蓬松等临床症状，2只小白鼠在接种细菌48 h内死亡。对照组小白鼠正常。
2.7 药敏试验及防治
分离链球菌对万古霉素、亚胺培南、利奈唑胺和菌必治高度敏感，对阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻肟、呋喃妥因和替加环素中度敏感，对卡多西环素、多粘菌素、青霉素、链霉素、恩诺沙星等药物不敏感。
该猪场根据药敏结果，选用中敏的氟苯尼考对全场猪群通过饮水进行治疗，对发病猪群注射阿莫西林每天1次，连续2 d，同时加强饲养管理、环境消杀，5 d后疫情得了有效控制。
3 结论与讨论
3.1 本研究对病料进行了猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒性疾病检测，结果都为阴性，从病料的肺脏中分离到1株细菌，通过对分离细菌的形态观察、培养特性、生化试验和PCR鉴定，该细菌为偏向厌氧的革兰氏阳性球菌，在鲜血琼脂平板上培养良好，在麦康凯琼脂平板上不生长，与刘玉涛等[6]于2014年分离报道的细菌具有类似特性。根据细菌分离鉴定结果，结合猪场的发病情况、临床症状、剖检变化和治疗效果，确诊该猪场发生疫病的病原主要为链球菌病。究其发病原因，主要是在饲料中全面禁止使用抗生素后，虽然规模猪场加强了生物安全防控措施，通过除臭改善了饲养环境，但在细菌病防控的思想上出现了松懈，导致在猪场出现细菌性疾病的概率有所增加。
3.2 根据小白鼠攻毒试验表明，该分离菌株对小白鼠具有较强的致病性，48 h内可导致小白鼠死亡，说明该分离菌有较强毒力。在一定的条件下，猪场如饲养管理条件较差，猪群免疫功能较低和气候变化等应激因素较大的情况下，可能导致保育猪的急性发病和死亡。鉴此，各规模养殖场应该加强细菌性疾病防控措施，做好环境消杀工作，加强臭管理，改善饲养环境，提高猪群免疫力[7]，确保猪群健康养殖。
3.3 在非洲猪瘟背景下，猪群疫病防控策略有所改进，在生猪养殖生物安全防控措施方面得到很大加强，这有利于减少病原传播，防堵疫情暴发。猪链球菌病在我国于20世纪50年代开始报道，虽然现已有商品的疫苗，但由于猪链球菌的血清型众多和抗生素可以防治的特点，导致猪场使用疫苗的频率较少。因此，建议各规模猪场在建立并执行严格的生物安全措施情况下，也要重视并做好各种疫苗的免疫和保健工作，提高猪群免疫功能;另外，规模猪场对于细菌性疾病的防控，在选用防治药物的环节方面，最好采用科学的药敏试验结果，根据药敏药物做到有针对性的防治，这在猪场取得良好防控效果的同时，有利于减少细菌耐药和确保猪肉食品安全，有利于促进生猪产业健康高效发展。
参考文献：
[1]王文，范方程，邓瑞德，等.湖南湘潭某猪场保育猪链球菌分离鉴定及耐药性试验[J].养猪，2021（3）：101-103.
[2]梁学勇.动物传染病[M].重庆：重庆大学出版社，2007.
[3]耿艳红，徐军，王兆山，等.猪链球菌病[J].动物医学进展，2005，26（9）：101-104.
[4]郭长明，陈怀君，朱善元，等.广西某猪场猪链球菌分离鉴定及其生物学特性研究[J].中国畜牧兽医，2021，48（2）：736-746.
[5]幸文定，曾文斌，刘悦欣，等.一起猪链球菌病的临床分离鉴定及诊治[J].养猪，2015（1）：92.
[6]刘玉涛，吴秋玉，王隆柏，等.一株猪链球菌的分离与鉴定[J].福建畜牧兽医，2014，36（4）：20-21.
[7]胡换仪，林敏，刘小兰，等.一例猪链球菌病的诊断及其病原分离鉴定[J].江西畜牧兽医杂志，2021（1）：9-12.
（责任编辑：柯文辉）
关键词：猪链球菌;分离鉴定;防治
中图分类号：S 852.61 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）07-0026-04
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.004
Isolation， Identification and Prevention of a Strain of Streptococcus Suis
WANG Longbai1， ZHENG Liying2， CHEN Qiuyong1， WU Xuemin1，CHEN Rujing1， CHE Yongliang1， ZHOU Lunjiang1*
（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Fujian Academy of Agricultural
Sciences， Fuzhou， Fujian 350013， China; 2. Yanping District Center of Animal
Disease Prevention and Control， Nanping， Fujian 353000， China）
Abstract： A bacterial strain was isolated from the lungs of weaned pigs in the infected intensive pig farm in Fujian Province. According to the morphological observation， biochemical test， cultural characteristics， PCR identification and animal challenge test of the isolated bacteria， and combined with the clinical symptoms and pathological changes of the infected pigs， it was indicated that the isolated bacteria was partial to anaerobic Streptococcus， which had the characteristics of good culture on blood plate and could cause the disease and death of mice. The drug sensitivity test showed that the isolated Streptococcus was highly sensitive to vancomycin， imipenem， linezolid and rocephin， and was moderately sensitive to amoxicillin， florfenicol， cefotaxime， macrodantin and tigecycline， while was not sensitive to the drugs such as cardoxycycline， polymyxin， penicillin， streptomycin， and enrofloxacin. According to the results of drug sensitivity， the pig farm should take emergency prevention and control measures， and the epidemic could be effectively controlled 5 days later.
Key words： Streptococcus suis; Isolation and identification; Prevention and treatment
自2018年我国首次报道发生非洲猪瘟以来，各规模养殖场都强化了生物安全防控措施和疫病综合防控举措，猪场发生病毒性传染病（如猪流行性腹泻、圆环病毒病等）的情况有所减少。但由于如今在饲料中全面禁抗和对细菌性疾病防控的疏忽[1]，导致发生猪细菌性的疾病有所增加，比如胀气梭菌和猪链菌病等。猪链球菌病（Strep tococcosis swine ）是由不同群的链球菌引起的不同临床症状传染病的总称[2]。该病病原主要为C群的兽疫链球菌及类马链球菌、D群的猪链球菌、以及E、L、S、R等群[3]，一年四季均可发生，但在闷热潮湿的天气更多发。根究猪群感染链球菌的临床表现，可分为脑膜炎型、败血型、化脓性关节炎型及淋巴结炎型等[4]。
2020年8月，福建某存栏约600头母猪的规模猪场，保育猪出现发病和死亡，发病率达30%，死亡率达12%，临床症状主要表现为食欲减退、体温升高、呼吸困难和个别头往后仰等神经症状;经实验室对病料进行细菌分离鉴定，及对分离菌的形态学观察、生化和PCR鉴定、动物攻毒和药敏试验，证实分离到1株猪链球菌。猪场根据诊治结果，采取紧急防控措施，疫情最终获得有效控制。 1 材料与方法
1.1 试验材料
2头疑似发病保育猪的肺脏来源于福建某发病规模猪场;普通琼脂板、绵羊血琼脂平板和麦康凯琼脂平板由福建省农业科学院畜牧兽医研究所自制;革兰氏染色试剂和生化试剂购自广东环凯微生物科技有限公司;药敏试纸购自北京天坛药物生物技术开发有限公司;昆明小白鼠购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌分离培养 在超净台内用细菌接种针在病死猪肺脏划线接种于血琼脂平板，然后放置在37℃的培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况。选取单个菌落进行革兰氏染色后观察细菌的形态特点。
1.2.2 细菌培养特征 将分离菌接种于血琼脂平板、麦康凯琼脂平板和普通琼脂平板各2组，分别放置于有氧和厌氧环境下培养，观察细菌的生长情况。
1.2.3 细菌生化鉴定 按生化试剂盒说明书进行细菌生化鉴定。将细菌分别接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、肌醇、木糖、鼠李糖、棉仔糖、硫化氢、靛基质等生化鉴定管中，培养18～24 h观察生化鉴定结果。
1.2.4 细菌PCR鉴定 按参考文献[5]进行。根据猪链球菌16S rRNA设计引物，扩增片段长度为688 bp。
1.2.5 动物攻毒试验 将8只昆明小白鼠，分成2组，分别为试验组和对照组各4头。试验组通过腹腔接种分离菌液（1×107 CFU·mL-1）0.2 mL·只
-1，对照组每只分别注射等剂量的生理盐水。两组分别隔离饲养观察。
1.2.6 药敏试验 采用药敏纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验，取100 μL细菌液（1×107 CFU·mL-1）涂布于血平板培养基，在培养基面貼上不同药敏纸片，置于37℃培养24 h后，按说明判定标准对结果进行分析。
2 结果与分析
2.1 发病猪临床症状和病理变化
发病猪只的临床症状主要表现为食欲不振或废绝，精神沉郁（图1），体温为40～42℃，鼻腔有浆性鼻汁流出，腹式呼吸，个别出现运动失调，四肢划水，头往后仰等神经症状，濒死体温下降;病理变化主要表现为肺脏出血、肉变（图2）和脑膜充血，淋巴结肿大、出血，肾脏有出血点。
2.2 细菌形态学观察
从病料的肺脏中分离到1株细菌，该细菌在鲜血琼脂平板上培养18～24 h后，长出半透明、圆形、光滑、边缘整齐的溶血性菌落（图3）;革兰氏染色阳性，菌体呈圆形，短链，主要以5～18个菌体链状排列，可见单个长达20个以上菌体相连的长链状（图4）。
2.3 细菌培养特征
经不同培养基和不同环境下培养发现，该菌在麦康凯琼脂平板无论是在厌氧还是在有氧条件下都不能生长，在普通琼脂平板可生长、鲜血平板培养在厌氧比有氧条件下生长更好。
2.4 细菌生化鉴定
培养18 h后观察生化鉴定结果，发现该菌可发酵蔗糖、果糖、肌醇、葡萄糖和乳糖;不能发酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖、麦芽糖、木糖、硫化氢、棉仔糖和靛基质;以上生化鉴定符合链球菌生化特性。
2.5 细菌PCR鉴定
分离菌经PCR反应，获得大约688 bp大小的目的条带，与预期大小一致（图5）。
2.6 动物攻毒试验
分离细菌接种小白鼠12 h后，开始出现活动减少、精神沉郁、被毛蓬松等临床症状，2只小白鼠在接种细菌48 h内死亡。对照组小白鼠正常。
2.7 药敏试验及防治
分离链球菌对万古霉素、亚胺培南、利奈唑胺和菌必治高度敏感，对阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻肟、呋喃妥因和替加环素中度敏感，对卡多西环素、多粘菌素、青霉素、链霉素、恩诺沙星等药物不敏感。
该猪场根据药敏结果，选用中敏的氟苯尼考对全场猪群通过饮水进行治疗，对发病猪群注射阿莫西林每天1次，连续2 d，同时加强饲养管理、环境消杀，5 d后疫情得了有效控制。
3 结论与讨论
3.1 本研究对病料进行了猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒性疾病检测，结果都为阴性，从病料的肺脏中分离到1株细菌，通过对分离细菌的形态观察、培养特性、生化试验和PCR鉴定，该细菌为偏向厌氧的革兰氏阳性球菌，在鲜血琼脂平板上培养良好，在麦康凯琼脂平板上不生长，与刘玉涛等[6]于2014年分离报道的细菌具有类似特性。根据细菌分离鉴定结果，结合猪场的发病情况、临床症状、剖检变化和治疗效果，确诊该猪场发生疫病的病原主要为链球菌病。究其发病原因，主要是在饲料中全面禁止使用抗生素后，虽然规模猪场加强了生物安全防控措施，通过除臭改善了饲养环境，但在细菌病防控的思想上出现了松懈，导致在猪场出现细菌性疾病的概率有所增加。
3.2 根据小白鼠攻毒试验表明，该分离菌株对小白鼠具有较强的致病性，48 h内可导致小白鼠死亡，说明该分离菌有较强毒力。在一定的条件下，猪场如饲养管理条件较差，猪群免疫功能较低和气候变化等应激因素较大的情况下，可能导致保育猪的急性发病和死亡。鉴此，各规模养殖场应该加强细菌性疾病防控措施，做好环境消杀工作，加强臭管理，改善饲养环境，提高猪群免疫力[7]，确保猪群健康养殖。
3.3 在非洲猪瘟背景下，猪群疫病防控策略有所改进，在生猪养殖生物安全防控措施方面得到很大加强，这有利于减少病原传播，防堵疫情暴发。猪链球菌病在我国于20世纪50年代开始报道，虽然现已有商品的疫苗，但由于猪链球菌的血清型众多和抗生素可以防治的特点，导致猪场使用疫苗的频率较少。因此，建议各规模猪场在建立并执行严格的生物安全措施情况下，也要重视并做好各种疫苗的免疫和保健工作，提高猪群免疫功能;另外，规模猪场对于细菌性疾病的防控，在选用防治药物的环节方面，最好采用科学的药敏试验结果，根据药敏药物做到有针对性的防治，这在猪场取得良好防控效果的同时，有利于减少细菌耐药和确保猪肉食品安全，有利于促进生猪产业健康高效发展。
参考文献：
[1]王文，范方程，邓瑞德，等.湖南湘潭某猪场保育猪链球菌分离鉴定及耐药性试验[J].养猪，2021（3）：101-103.
[2]梁学勇.动物传染病[M].重庆：重庆大学出版社，2007.
[3]耿艳红，徐军，王兆山，等.猪链球菌病[J].动物医学进展，2005，26（9）：101-104.
[4]郭长明，陈怀君，朱善元，等.广西某猪场猪链球菌分离鉴定及其生物学特性研究[J].中国畜牧兽医，2021，48（2）：736-746.
[5]幸文定，曾文斌，刘悦欣，等.一起猪链球菌病的临床分离鉴定及诊治[J].养猪，2015（1）：92.
[6]刘玉涛，吴秋玉，王隆柏，等.一株猪链球菌的分离与鉴定[J].福建畜牧兽医，2014，36（4）：20-21.
[7]胡换仪，林敏，刘小兰，等.一例猪链球菌病的诊断及其病原分离鉴定[J].江西畜牧兽医杂志，2021（1）：9-12.
（责任编辑：柯文辉）