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摘要：利用植酸盐分子中磷酸基团与部分金属离子的强络合能力，通过微波合成法合成植酸钛纳米材料，并运用这种材料结合混合滴涂的方法将辣根过氧化物酶成功修饰到玻碳电极表面.运用紫外-可见光谱和电化学，实验结果证明了这种材料具有良好的生物相容性，有利于防止酶在固定化过程中生物活性的损害.此法制备的生物传感器实现了辣根过氧化物酶 （HRP）和玻碳电极之间的直接电子转移，且对过氧化氢呈现出良好的催化还原作用，对H2O2检测的响应电流线性范围是6.67×10-7～4.73×10-5mol·L-1，线性相关系数R=0.9988 （n=20），检测限为4.0×10-7mol·L-1 （S/N = 3），米氏常数 （KappM）为0.036 mmol·L-1.所制得的生物传感器呈现出良好的重现性和稳定性.
关键词： 植酸钛纳米材料； 辣根过氧化物酶； 过氧化氢
中图分类号： O 657.1 文献标识码： A 文章编号： 10005137（2014）02016807
0引言
近年来，具有层状结构的磷酸盐已被人们广泛研究.其制备方法一般主要有溶胶凝胶法[1]、水热合成法[2]、溶剂热合成法[3]等.微波合成法是最近迅速发展起来的一种绿色、快速、高效的材料合成新技术[4]，自20世纪70年代中期，Hesek等[5]将微波技术应用于分析化学中开始，微波合成法以其独特的加热方式受到科研人员的密切关注，并进行了大量的相关研究工作.
目前，微波合成法已被广泛用于磷酸铝分子筛和硅酸铝沸石的合成中[6-8].传统的加热方式是靠辐射、对流、传导等3种方式由表及里加热，而微波加热不同于此，其具有其他合成方法不可比拟的优点：受热均匀，加热速度快，结晶迅速[7]，粒径小且均匀[9-11]，副反应少，产物相对单纯[12]等.最近，有报道指出，由于微波合成法结晶迅速，应用此方法可以使合成的产物孔径增大[13].因此，微波合成法是一种有效合成材料的方法.
植酸为环境友好型的分子[14]，植酸 （IP6或PA）是一类天然物质，在许多植物组织，特别是在麸类和种子中，作为磷的主要存在形式.它具备一些独特的优点，如生物相容性好，无毒和对环境友好.符合当今的科研时代趋势.每个植酸分子可提供6对氢原子使自由基的电子形成稳定结构，通过研究小组前期的工作已经了解到[15-16]，将一定浓度的植酸钠加热，可形成植酸胶束，用于纳米粒子的稳定剂和表面活性剂，有效地保护了纳米粒子.
辣根过氧化物酶 （Horseradish Peroxidase，HRP）是一种性质稳定，活性高、商品化较早的生物分子.它可以作为一种生物合成和转化的试剂，被广泛应用在生物传感器、废水处理、环境化学等领域，是研究最多的一种过氧化物酶.过氧化物酶在生物体内以及食物药物中有着重要影响，生物体内许多过氧化物酶参与的酶促反应的副产物是过氧化氢 （H2O2），因此通过检测过氧化氢的含量来研究过氧化物酶的动力学和热力学性质，为了解生物体内的生命现象提供了可能.在检测的众多方法中，电化学生物传感器方法可以实现对H2O2的快速、高效的检测，因此，过氧化物酶电化学传感器在H2O2的检测中发挥着重要作用.同时，随着酶固定化技术的发展和新检测方法的应用，辣根过氧化物酶传感器的检测性能不断提高，应用领域也不断拓展.
本研究尝试利用微波合成法快速合成纳米植酸钛材料，并通过FESEM表征发现它具有多孔结构.进而，运用这种材料结合混合滴涂的方法将HRP成功修饰到电极表面制备了一种过氧化氢传感器.紫外可见光谱和电化学实验结果证明了这种材料良好的生物相容性，该法制备的生物传感器表现出良好的电化学性能.
1实验部分
1.1实验试剂
硫酸钛 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；植酸钠 （IP6，分析纯，Aldrich公司）；辣根过氧化物酶 （HRP，EC 1.11.1.7，RZ>3.0，A>250 U·mg-1，上海丽珠东风生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲溶液 （PBS，67 mmol·L-1）由KH2PO4和Na2HPO4调配而成，不同pH的缓冲溶液用0.1 mol·L-1的NaOH与H3PO4调节得到；所有实验用水均为超纯水 （18.2 MΩ·cm）.
1.2仪器
CHI660D型电化学工作站 （上海辰华仪器有限公司），电化学实验采用常规三电极体系：修饰电极 （自制）为工作电极，铂电极作辅助电极，饱和甘汞电极作参比电极；760CRT型紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）；场发射扫描电子显微镜 （FESEM）图由Hitachi S-4800型扫描电镜得；FE20型pH计 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；SK2200H型超声清洗器 （上海科导超声仪器有限公司）.
1.3实验方法
3结论
利用植酸盐分子中磷酸基团与部分金属离子的强络合能力，通过微波合成法合成了新颖的植酸钛纳米材料，并运用这种材料结合混合滴涂的方法将HRP成功修饰到固定到玻碳电极表面.紫外可见光谱和电化学实验结果证明了这种材料良好的生物相容性，有利于防止酶在固定化过程中生物活性的损害.此法制备的生物传感器实现了HRP和玻碳电极之间的直接电子转移，且对过氧化氢呈现出良好的电催化还原作用，同时具有良好的稳定性和重现性.
参考文献：
[1]LOUREIRO J M，KARTEL M T.Combined and hybrid adsorbents [M].Germany：Springer，2006.
[2]EKAMBARA S M，SERRE C，FE’CREY G，et al.Hydrothermal synthesis and characterizationof an ethylenediaminetemplated mixedvalence titanium phosphate [J].Chem Mater，2000，12（2）：444-449. [3]GUO Y H，SHI Z，YU J H，et al.Solvothermal synthesis and characterization of a newtitanium phosphate with a onedimensional chiralchain [J].Chem Mater，2001，13（1）：203-207.
[4]王继业，许赤兵，宋会花，等.微波加热在无机固相反应中的应用[J].河北师范大学学报：自然科学版，2004，28（4）：396-400.
[5]HESEK J A，WILSON R C.Use of a microwave oven in inprocess control [J].Anal Chem，1974，46（8）：1160-1161.
[6]ARAFAT A，JANSEN J C，EBAID A R，et al.Microwave preparation of zeolite Y and ZSM-5 [J].Zeolites，1993，13（3）：162-165.
[7]PARK M，KOMARNENI S.Rapid synthesis of AlPO4-11 and cloverite by microwavehydrothemal processing [J].Micropor Mesopor Mater，1998，20（1-3）：39-44.
[8]TOMPSETT G A，CONNER W C，YNGVESSON K S.Microwave synthesis of nanoporous materials [J].Chem Phys Chem，2006，7 （2）：296-319.
[9]XU X C，YANG W S，LIU J，et al.Synthesis of a highpermeanceNaA zeolite membrane by microwave heating [J].Adv Mater，2000，12（3）：195-198.
[10]JHUNG S H，JIN T，HWANG Y K，et al.Microwave effect in the fast synthesis of microporous materials：which stage between nucleation and crystal growth is accelerated by microwave irradiation [J].Chem Eur J，2007，13（16）：4410-4417.
[11]JHUNG S H，LEE J H，CHAN J S G.Crystal size control of transition metal ionincorporated aluminophosphate molecular sieves：Effect of ramping rate in the synthesis [J].Micropor Mesopor Mater，2008，112（1-3）：178-186.
[12]JHUNG S H，CHANG J S，HWANG J S，et al.Selective formation of SAPO-5 and SAPO-34 molecular sieves with microwave irradiation and hydrothermal heating [J].Micropor Mesopor Mater，2003，64（1-3）：33-39.
[13]JHUNG S H，JIN T，KIM Y H，et al.Phaseselective crystallization of cobaltincorporated aluminophoshate molecular sieves with large pore by microwave irradiation [J].Micropor Mesopor Mater，2008，109（1-9）：58-65.
[14]CREA F，STEFANO C D，MILEA D，et al.Formation and stability of phytate complexes in solution [J].Coordin Chem Rev，2008，252：1108-1120.
[15]WANG N，WEN Y，YANG H F，et al.Facile and controlled synthesis of selfconjugated Ag@IP6-micelle compositions for surfaceenhanced spectroscopic application[J].J Mate Chem，2010，20，2317-2321.
[16]WANG N，WEN Y，YANG H F，et al.The IP6@micellestabilized small Ag cluster for synthesizing Ag–Au alloy nanoparticles and the tunable surface plasmon resonance effect[J].Nanotechnol，2012，23：145702-145708.
[17]SHIRE S J，HANANIA G I H，GURD F R N.Electrostatic effects in myoglobin.Hydrogen ion equilibriums in sperm whale ferrimyoglobin[J].Biochemistry，1974，13：2967-2974. [18]KAMIN R A，WILSON G S.Rotating ringdisk enzyme electrode for biocatalysis kinetic studies and characterization of the immobilized enzyme layer [J].Anal Chem，1980，52：1198-1205.
Abstract： Due to the strong chelating ability between phosphates groups in phytate and metal ions，we synthesized a new porous nanomaterialstitaniumphytate by the method of microware.Then，we tried to employ the nanoporous film of titaniumphytate as a substrate for making the horseradish peroxidase（HRP） based biosensor by dropcoating method and investigate theelectrochemical behavior of enzyme.The UVvis absorption spectroscopy and electrochemical results showed that this kind of material has a great biological affinity and it can prevent damage to biological activity of enzyme during immobilization.The asprepared biosensor realized direct electron transfer between the immobilized HRP and glassy carbon electrode and displayed good bioelectrocatalytic ability toward the reduction of H2O2 with a linear response to H2O2 over a concentration range from 6.67×10-7 to 4.73×10-5 mol·L-1，and a detection limit of 4×10-7 mol·L-1 at a signaltonoise ratio （S/N）= 3.The Michaelis–Menten constant KappM was estimated to be 0.036 mmol·L-1.The as prepared biosensor exhibited good reproducibility and stability.
Key words： Phytic titanium nanoparticles； horseradish peroxidase （HRP）； H2O2
（责任编辑：郁慧）
关键词： 植酸钛纳米材料； 辣根过氧化物酶； 过氧化氢
中图分类号： O 657.1 文献标识码： A 文章编号： 10005137（2014）02016807
0引言
近年来，具有层状结构的磷酸盐已被人们广泛研究.其制备方法一般主要有溶胶凝胶法[1]、水热合成法[2]、溶剂热合成法[3]等.微波合成法是最近迅速发展起来的一种绿色、快速、高效的材料合成新技术[4]，自20世纪70年代中期，Hesek等[5]将微波技术应用于分析化学中开始，微波合成法以其独特的加热方式受到科研人员的密切关注，并进行了大量的相关研究工作.
目前，微波合成法已被广泛用于磷酸铝分子筛和硅酸铝沸石的合成中[6-8].传统的加热方式是靠辐射、对流、传导等3种方式由表及里加热，而微波加热不同于此，其具有其他合成方法不可比拟的优点：受热均匀，加热速度快，结晶迅速[7]，粒径小且均匀[9-11]，副反应少，产物相对单纯[12]等.最近，有报道指出，由于微波合成法结晶迅速，应用此方法可以使合成的产物孔径增大[13].因此，微波合成法是一种有效合成材料的方法.
植酸为环境友好型的分子[14]，植酸 （IP6或PA）是一类天然物质，在许多植物组织，特别是在麸类和种子中，作为磷的主要存在形式.它具备一些独特的优点，如生物相容性好，无毒和对环境友好.符合当今的科研时代趋势.每个植酸分子可提供6对氢原子使自由基的电子形成稳定结构，通过研究小组前期的工作已经了解到[15-16]，将一定浓度的植酸钠加热，可形成植酸胶束，用于纳米粒子的稳定剂和表面活性剂，有效地保护了纳米粒子.
辣根过氧化物酶 （Horseradish Peroxidase，HRP）是一种性质稳定，活性高、商品化较早的生物分子.它可以作为一种生物合成和转化的试剂，被广泛应用在生物传感器、废水处理、环境化学等领域，是研究最多的一种过氧化物酶.过氧化物酶在生物体内以及食物药物中有着重要影响，生物体内许多过氧化物酶参与的酶促反应的副产物是过氧化氢 （H2O2），因此通过检测过氧化氢的含量来研究过氧化物酶的动力学和热力学性质，为了解生物体内的生命现象提供了可能.在检测的众多方法中，电化学生物传感器方法可以实现对H2O2的快速、高效的检测，因此，过氧化物酶电化学传感器在H2O2的检测中发挥着重要作用.同时，随着酶固定化技术的发展和新检测方法的应用，辣根过氧化物酶传感器的检测性能不断提高，应用领域也不断拓展.
本研究尝试利用微波合成法快速合成纳米植酸钛材料，并通过FESEM表征发现它具有多孔结构.进而，运用这种材料结合混合滴涂的方法将HRP成功修饰到电极表面制备了一种过氧化氢传感器.紫外可见光谱和电化学实验结果证明了这种材料良好的生物相容性，该法制备的生物传感器表现出良好的电化学性能.
1实验部分
1.1实验试剂
硫酸钛 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；植酸钠 （IP6，分析纯，Aldrich公司）；辣根过氧化物酶 （HRP，EC 1.11.1.7，RZ>3.0，A>250 U·mg-1，上海丽珠东风生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲溶液 （PBS，67 mmol·L-1）由KH2PO4和Na2HPO4调配而成，不同pH的缓冲溶液用0.1 mol·L-1的NaOH与H3PO4调节得到；所有实验用水均为超纯水 （18.2 MΩ·cm）.
1.2仪器
CHI660D型电化学工作站 （上海辰华仪器有限公司），电化学实验采用常规三电极体系：修饰电极 （自制）为工作电极，铂电极作辅助电极，饱和甘汞电极作参比电极；760CRT型紫外可见分光光度计 （上海精密科学仪器有限公司）；场发射扫描电子显微镜 （FESEM）图由Hitachi S-4800型扫描电镜得；FE20型pH计 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；SK2200H型超声清洗器 （上海科导超声仪器有限公司）.
1.3实验方法
3结论
利用植酸盐分子中磷酸基团与部分金属离子的强络合能力，通过微波合成法合成了新颖的植酸钛纳米材料，并运用这种材料结合混合滴涂的方法将HRP成功修饰到固定到玻碳电极表面.紫外可见光谱和电化学实验结果证明了这种材料良好的生物相容性，有利于防止酶在固定化过程中生物活性的损害.此法制备的生物传感器实现了HRP和玻碳电极之间的直接电子转移，且对过氧化氢呈现出良好的电催化还原作用，同时具有良好的稳定性和重现性.
参考文献：
[1]LOUREIRO J M，KARTEL M T.Combined and hybrid adsorbents [M].Germany：Springer，2006.
[2]EKAMBARA S M，SERRE C，FE’CREY G，et al.Hydrothermal synthesis and characterizationof an ethylenediaminetemplated mixedvalence titanium phosphate [J].Chem Mater，2000，12（2）：444-449. [3]GUO Y H，SHI Z，YU J H，et al.Solvothermal synthesis and characterization of a newtitanium phosphate with a onedimensional chiralchain [J].Chem Mater，2001，13（1）：203-207.
[4]王继业，许赤兵，宋会花，等.微波加热在无机固相反应中的应用[J].河北师范大学学报：自然科学版，2004，28（4）：396-400.
[5]HESEK J A，WILSON R C.Use of a microwave oven in inprocess control [J].Anal Chem，1974，46（8）：1160-1161.
[6]ARAFAT A，JANSEN J C，EBAID A R，et al.Microwave preparation of zeolite Y and ZSM-5 [J].Zeolites，1993，13（3）：162-165.
[7]PARK M，KOMARNENI S.Rapid synthesis of AlPO4-11 and cloverite by microwavehydrothemal processing [J].Micropor Mesopor Mater，1998，20（1-3）：39-44.
[8]TOMPSETT G A，CONNER W C，YNGVESSON K S.Microwave synthesis of nanoporous materials [J].Chem Phys Chem，2006，7 （2）：296-319.
[9]XU X C，YANG W S，LIU J，et al.Synthesis of a highpermeanceNaA zeolite membrane by microwave heating [J].Adv Mater，2000，12（3）：195-198.
[10]JHUNG S H，JIN T，HWANG Y K，et al.Microwave effect in the fast synthesis of microporous materials：which stage between nucleation and crystal growth is accelerated by microwave irradiation [J].Chem Eur J，2007，13（16）：4410-4417.
[11]JHUNG S H，LEE J H，CHAN J S G.Crystal size control of transition metal ionincorporated aluminophosphate molecular sieves：Effect of ramping rate in the synthesis [J].Micropor Mesopor Mater，2008，112（1-3）：178-186.
[12]JHUNG S H，CHANG J S，HWANG J S，et al.Selective formation of SAPO-5 and SAPO-34 molecular sieves with microwave irradiation and hydrothermal heating [J].Micropor Mesopor Mater，2003，64（1-3）：33-39.
[13]JHUNG S H，JIN T，KIM Y H，et al.Phaseselective crystallization of cobaltincorporated aluminophoshate molecular sieves with large pore by microwave irradiation [J].Micropor Mesopor Mater，2008，109（1-9）：58-65.
[14]CREA F，STEFANO C D，MILEA D，et al.Formation and stability of phytate complexes in solution [J].Coordin Chem Rev，2008，252：1108-1120.
[15]WANG N，WEN Y，YANG H F，et al.Facile and controlled synthesis of selfconjugated Ag@IP6-micelle compositions for surfaceenhanced spectroscopic application[J].J Mate Chem，2010，20，2317-2321.
[16]WANG N，WEN Y，YANG H F，et al.The IP6@micellestabilized small Ag cluster for synthesizing Ag–Au alloy nanoparticles and the tunable surface plasmon resonance effect[J].Nanotechnol，2012，23：145702-145708.
[17]SHIRE S J，HANANIA G I H，GURD F R N.Electrostatic effects in myoglobin.Hydrogen ion equilibriums in sperm whale ferrimyoglobin[J].Biochemistry，1974，13：2967-2974. [18]KAMIN R A，WILSON G S.Rotating ringdisk enzyme electrode for biocatalysis kinetic studies and characterization of the immobilized enzyme layer [J].Anal Chem，1980，52：1198-1205.
Abstract： Due to the strong chelating ability between phosphates groups in phytate and metal ions，we synthesized a new porous nanomaterialstitaniumphytate by the method of microware.Then，we tried to employ the nanoporous film of titaniumphytate as a substrate for making the horseradish peroxidase（HRP） based biosensor by dropcoating method and investigate theelectrochemical behavior of enzyme.The UVvis absorption spectroscopy and electrochemical results showed that this kind of material has a great biological affinity and it can prevent damage to biological activity of enzyme during immobilization.The asprepared biosensor realized direct electron transfer between the immobilized HRP and glassy carbon electrode and displayed good bioelectrocatalytic ability toward the reduction of H2O2 with a linear response to H2O2 over a concentration range from 6.67×10-7 to 4.73×10-5 mol·L-1，and a detection limit of 4×10-7 mol·L-1 at a signaltonoise ratio （S/N）= 3.The Michaelis–Menten constant KappM was estimated to be 0.036 mmol·L-1.The as prepared biosensor exhibited good reproducibility and stability.
Key words： Phytic titanium nanoparticles； horseradish peroxidase （HRP）； H2O2
（责任编辑：郁慧）